Præsentation af artiklen ”Identification of Yersinia
enterocolitica genes affecting survival in an animal
host using signature-tagged transposon mutagenesis.”
Andrew J. Darwin & Virginia L. Miller, 1999.
Indledning
Jeg vil her gennemgå de væsentligste pointer fra
den ovenstående artikel fra det velansete
tidsskrift Molecular Microbiology.
Først vil jeg komme med baggrunden for at
undersøgelsen blev udført, hvad forfatternes
formål og hypotese var, hvordan de gjorde, hvad
de fandt ud af og slutteligt vil jeg kommentere
resultaternes betydning.
Baggrund
Tre arter af Yersinia slægten, en Gram-negativ,
stavformet og fakultativ anaerob enterobakterie,
er patogene for mennesker. Disse tre arter er Y.
pestis, Y. pseudotuberculosis og Y. enterocolitica
og de er forbundet med både lokale og systemiske
infektioner. Det er den sidste af disse bakterier
forfatterne her beskæftiger sig med, men
resultaterne er dog sigende for alle tre arter. Man
har tidligere identificeret et 70kb virulensplasmid
hos Yersinia, kaldet pYV, der kan findes i alle tre
arter. Generne på dette plasmid koder for mange
virulensfaktorer såsom type III sekretionssystem
(TTSS) (omtales senere) samt effektorproteinerne
til sekretion. Det er dog vist at pYV ikke er alene
om virulensen, men at der også er kromosomale
gener involveret. Bland andet er der gener der
koder for adhæsion og indtrængen i værtscellen,
binding af jern (siderophorersyntese) samt
syntese af lipopolysakkarid O-antigen.
Formål og hypotese
Efterhånden som sekvensering af hele genomer er
blevet lettere, har man genetisk kortlagt flere
patogene bakterier. Dog mangler man stadig
megen indsigt i hvilke gener der koder for hvilke
proteiner, og i særdeleshed hvilke gener der er
involveret i bakteriers virulensmønster.
Grundet besværligheder med at skulle teste hver
enkelt mutants virulensegenskaber og tilhørende
gener i et testdyr, havde det på daværende
tidspunkt ikke tidligere været muligt at lave
storskalaforsøg, der skulle kortlægge netop dette
for hele genomer. Det kan man nu ved hjælp af
signature-tagged mutagenesis (STM). Her vil
forfatterne lave en lang række mutanter, og en del
af disse vil være med forringede virulensegenskaber,
simultant teste flere stammer i en
enkelt vært, og derefter finde ud af hvilke gener
der i det givne tilfælde er forstyrret.
De forventer fra forsøgets start at en række af
deres mutanter vil være muteret i pYV, og at disse
vil have kraftigt forringet virulens. Derudover
håber de at opdage gener på kromosomet der
enten ikke er kendte, eller ikke er kendte i
forbindelse med virulens og overlevelse i vært.
Metode
En række signature-tagged mutanter blev
fremstillet med ved at pUT vektoren indeholdende
mini-Tn5 Km2 transposonet blev indsat i E. coli
stammen CC118, og derefter overført til Y.
enterocolitica stammen JB580v via konjugation.
Disse mutanter blev screenet for insertion af det
omtalte transposon ved ampicilin selektion
(forskellig koloniseringsmønster med og uden
insert) og der blev udført Southern blot på 18
tilfældige prøver hvor der blev screenet for
kanamycinresistens, som sad på transposonet.
Indledende undersøgelser viste at den bedste
infektionsmetode på testdyrene (6-7 uger gamle
BALB/c hunmus) var intraperitoneal (IP) injicering
(direkte injicering i bughule), med ca. 107 colonyforming
units (cfu), efterfulgt af opsamling fra
milten efter 48 timer.
For at undgå at injicere med svækkede auxotrofe
bakterier, blev der selekteret transposonmutanter
dyrket på minimalmedie.
STM
Metoden til at screene for svækkede bakterier
blev som nævnt gjort med signture-tagged
mutagenesis (STM). STM er en negativ
selektionsmetode hvor de her i forsøget bruger
deres pulje af mutanter (21 puljer af 96 mutanter)
til at inficere grupper af tre mus. Det specielle ved
STM er, at det indsatte DNA har et specielt
signaturmærke, et signature tag, som er en lille
velkendt sekvens der efterfølgende kan findes ved
Southern blot hybridicering. I den indledende
screening inficeres musene og bakterier opsamles
fra milten. Disse blandes og overføres til 96
kammers mikrotitterplade. Herefter screener man
med proper på originalbakterierne (input – alle
originale mutanter) og de der var at finde i milten
(output - de overlevende). På den måde kan man
finde de svækkede bakterier ved deres manglende
tilstedeværelse i de fra milten opsamlede
bakterier (negativ selektion), hvilket ses som
manglende eller svag hybridicering i forhold til det
fra input (første del af fig. 1 fra artiklen). Herefter
tog man de mutanter der udviste manglende
hybridicering – altså svækket virulens, og kørte
secondary screening med samme procedure som
før, men med dobbeltbestemmelse (2x3 mus).
Hermed skulle man mindske risikoen for at udtage
mutanter der reelt ikke var svækkede (anden del
af fig. 1 fra artiklen).
Efterfølgende blev svækkede mutanter undersøgt
og klassificeret fænotypisk og ved kloning
efterfulgt af sekvensering, og der blev udført
konkurrence- og vækstassays.
Resultater
På baggrund af de to indledende STM screeninger
fandt de frem til 68 mutanter med svækket
virulens. Som forventet ville en del af disse være
muteret i pYV, og det blev da også fundet at 29
var pYV mutanter. Dette blev undersøgt ved
vækstmønster på LBMOX plader og kanamycinsensitivitet.
Dvs. at der ud af de oprindelige 68
mutanter var 39 der havde mutationer i
kromosomale virulensgener. Ud af disse blev der i
16 tilfælde observeret den samme fænotype
(aggregering i flydende medie samt uklar vækst på
LB agar plader) som skyldes en defekt i LPS
syntesen, og dermed syntesen af O-antigen, som
er essentiel for Y. enterocoliticas virulens. Altså
var der nu 23 mutanter tilbage, hvor mutationen
sad et andet sted end i pYV eller LPS syntese
generne. For at konfirmere hvorvidt de reelt var
svækket undersøgte man alle 68 i et konkurrence
assay i mus, hvor man målte om bakterierne
klarede sig dårligere end vildtype Y.
Enterocoliticas. Af denne test fandt man at 10 af
de 23 var reelt svækket og samlet set var 55 af de
68 reelt svækket. Dette i deres øjne gode resultat
tilskriver de den dobbelte STM screenings
procedure.
Ved pYV mutanterne var det især i type III
sekretionsgenerne at insertet var at finde og i
særdeleshed i lcrV og yscL, dette kunne tyde på et
’hot-spot’ for insertion af transposonet mini-Tn5
Km2 netop her (fig. 2 fra artiklen).
Af de 16 med formodning om mutation i LPS / Oantigen
synteseapparatet, blev dette verificeret
ved sekvensering (fig. 2 fra artiklen).
De sidste 10 kromosomale mutanter blev ligeledes
ved kloning og sekvensering undersøgt. Her fandt
man insertet, og dermed forstyrrelsen, i gener der
kodede for ydre membransyntese (yifH og nlpD),
næringsoptag/erhvervelse (pstC og irp1) og stress
respons (dnaJ). De sidste 5 havde mutationer i
gener homologe til E. coli gener der koder for DNA
topoisomerase I (topA), phage shock protein
operonet (pspC) og to blev fundet med
mutationer i yibP, et gen med ukendt funktion i E.
coli. Til sidst fandt man en mutation i en sekvens
der ikke gav noget resultat i GenBank databasen.
(Fig. 2 fra artiklen).
NB. I artiklen laver de en rekonstruktion af pspC
mutanten for nærmere undersøgelse. Dette vil jeg
forklare i forbindelse med spørgsmål 3 senere.
Diskussion
De fik med dette forsøg vist at STM teknikken kan
bruges til at identificere en række gener i Y.
enterocolitica med mere eller mindre betydning
for dens virulens. De fik reidentificeret en række
essentielle virulensgener i pYV (type III
sekretionssystem) og i LPS syntesegenerne på
kromosomet. Resultaterne fra de kromosomale
mutanter mindede om tidligere STM resultater fra
de patogene Gram-negative bakterier Salmonella
typhimurium og Vibrio cholera hvor man også
fandt at bakterier med mutationer i gener
involveret i O-antigensyntesen, stress respons og
næringsoptag/erhvervelse havde svækket
virulens. Det mest opsigtsvækkende de fandt ud
af, var at genet pspC, homolog til det gen der i E.
coli er en del af phage shock protein operonet,
havde betydning for Y. enterocoliticas’s virulens.
Denne mutant udviste meget ringe virulensgrad i
testdyret, men voksede fint in vitro. Dette gen har
i E. coli ingen kendt funktion, men man ser en øget
ekspression ved ekspression af sekretinproteiner,
der bl.a. bruges i type III sekretionssystemet. Altså
en formodet sammenhæng til vigtige virulensgener.
Der skal dog forskes yderligere i denne
sammenhæng for at forstå betydningen af pspC
genet og dets virulensfunktion.
Artiklen har den betydning, at den viser at en lang
række virulensgener kan identificeres ganske
hurtigt og relativt simpelt ved STM metoden.
Dette betyder at andre patogene bakterier, Grampositive
såvel som Gram-negative, hurtigt kan
screenes for virulensgener, hvilket kan have stor
betydning for sygdomsbehandling, lægemiddeludviklingen
og vores generelle kendskab til
patogene bakterier.
Derudover er det brugbart i forbindelse med at
flere og flere organismers (især bakterier) genom
sekvenseres, og at der er behov for at forstå
betydningen af de enkelte gener i den undersøgte
organisme.
Generelt virker artiklen vellavet i forhold til
forsøgenes opbygning, reproducerbarhed og den
generelle struktur i artiklen.
Specifikke spørgsmål
Spørgsmål 1:
Signature-tagged mutagenesis (STM) er en teknik
der bruges til at undersøge geners funktion in
vivo. Man laver et transposon med en velkendt
signatursekvens, som så overføres til den
organisme der skal undersøges oftest via E. coli.
Transposonet, med signaturtagget, sætter sig et
tilfældigt sted i genomet eller i et plasmid, og vil
dermed med stor sandsynlighed forstyrre og
ødelægge det gen og dermed det translaterede
protein. I STM har hver enkelt transposon sin egen
unikke signatur, og kan derfor efterfølgende
findes ved DNA probehybridicering (Southern
blot). Til forskel fra almindelig random transposon
mutagenesis (RTM) hvor man for hver enkelt
mutation skal bruge et testdyr til negativ kontrol,
kan man her bruge en hel pulje (i artiklens tilfælde
bruger de 96 pr. testdyr) og finde en specifik
svækket mutant. I det originale design af STM som
blev udformet af Hensel et al.1 brugte man som i
forsøget her hybridiseringsprober, nu kan en
anden metode med PCR detektion, udviklet af
Lehoux et al.2 bruges. Her er ideen at hver enkelt
tag amplificeres med tag-specifikke primere.
Tilstedeværelsen af et PCR produkt fra et tag i
input pool og fraværet af samme PCR produkt fra
output pool viser tabet af den specifikke mutant
under den negative selektionsscreening.
Fordelene ved STM med begge signature-tag
detektionsmetoder er således klare, da man både
sparer tid (og dermed penge) og testdyr. Egentlige
ulemper i forhold til RTM har jeg svært ved at
finde.
Spørgsmål 2:
I artiklen dobbeltscreener forfatterne deres
mutanter. Dette gøres ved at lave prober der er
lavet til at hybridisere til det indsatte transposon
(baseparringsprincip). Når man udtager bakterier
fra musens milt vil de bakterier der er at finde der,
være de som er i stand til at inficere musen, altså
de bakterier vi ikke ønsker at undersøge. Men hvis
man finder de bakterier der, så at sige, mangler
kan man så finde det gen der er forstyrret ved at
se på input poolen. Dette gør de for at det
primært er svækkede bakterier de injicerer, og på
baggrund af denne dobbeltscreening opnår de et
resultat der hedder at 55 af de oprindelige 68
mutanter reelt var svækkede, hvilket svarer til
81%. Dette er en forbedring i forhold til tidligere
resultater, hvor kun 45% af de screenede
mutanter var reelt svækkede (her screenede man
Vibrio cholera).
1 Hensel M, Shea JE, Gleeson C, Jones MD, Dalton E, Holden DW:
Simultaneous identification of bacterial virulence genes by negative
selection. Science 1995, 269:400-403.
2 Lehoux DE, Sanschagrin F, Levesque RC: Defined oligonucleotide tag
pools and PCR screening in signaturetagged mutagenesis of essential
genes from bacteria. Biotechniques 1999, 26:473-478, 480.
Spørgsmål 3:
I forsøget vil de fastslå om de fænotypiske
ændringer skyldes transposon mutagenesen eller
om der er tale om en spontan mutation. I alle på
nær en enkelt mutant kan de dog udelukke
spontan mutation. Undtagelsen er i homologen til
E. coli genet pspC. Derfor konstruerer forfatterne
tre nye pspC mutanter i samme stamme af Y.
enterocolitica. Den ene nye mutant skulle være en
kopi af den mutant fra det oprindelige forsøg,
mens de to andre skulle være mutanter med en
insertion-deletion i genet, med en kanamycinresistens
kassette. Kopien blev lavet ved at det
indsatte fragment fra originalen blev opformeret
ved PCR og ligeret ind i en vektor og overført til Y.
enterocolitica ved konjugation. De to andre blev
lavet ved at kanamycin-resistens kassetten blev
indsat i to forskellige orienteringer ved ligering. Af
disse tre nye bakterier blev der igen foretaget et
konkurrenceassay. Resultaterne af dette assay
med de rekonstruerede mutanter ses i tabel 3 i
artiklen, og det ses i sammenligning med pspC
resultatet fra det første konkurrenceassay (tabel
2) at resultaterne er meget identiske - mutanterne
inficerer musene i ringe grad, men gror fint in
virto. De fastslår derfor, at mutationer i pspC
homologen i Y. enterocolitica væsentlig svækker
dens virulens.
Spørgsmål 4:
Type III sekretionssystemet (TTSS) er en kompleks
transmembran proteinstruktur der findes i mange
Gram-negative bakterier, patogene og nonpatogene.
Hos de patogene bruges det især til at
udskille proteiner der hjælper bakterien med at
inficere sin vært, og der er derfor kraftig
sammenhæng mellem virulens og tilstedeværelsen
af TTSS. Hallmarket i systemet er nålen.
Den sidder forankret først til den indre membran i
den indre membranring, via en connector over
peptidoglykanlaget til den ydre membranring
hvorefter den har krydset hele bakteriens
vægsystem. Selve nålen er hul, med en diameter
på ca. 3 nm, hvilket betyder at de fleste effector
proteiner skal udskilles i udfoldet tilstand. (se fig.
1 nedenfor)
Figur 1. Skematisk tegning af TTSS. Fra Wikimedia Commons
Tidligere mente man, at selve nålen var i stand til
at perforere værtscellerne, men dette billede er
nu ændret. Nu er teorien at den udsender
proteiner kaldet translocators, der danner en pore
i værtens cellemembran, hvorigennem andre
effektorer kan strømme.
I artiklen bliver transposonet i en af mutanterne
indsat i en sycT-yopM gen region, og dette
formoder de kan affektere gener der er involveret
i TTSS . De undersøger om det er på grund af fejl i
udskillelsen af såkaldte Yop proteiner (Yersinia
outer proteins), som er med til at perforere
værtscellerne, der er årsag til den svækkede
virulens. Derfor undersøgte de proteinsammensætningen
i vækstmediet for de omtalte
mutanter, og sammenlignede med vildtype (fig. 2).
I det forsøg fandt de ingen synlig forskel i
proteinbilledet for mutanterne og vildtypen.
Spørgsmål 5:
Der findes mange bakterier der bruger TTSS i
forbindelse med deres virulens. Af disse arter kan
nævnes Shigella (bacillary dysenteri), Salmonella
(tyfus), Escherichia coli (madforgiftning),
Burkholderia (glanders), Yersinia (pest), Chlamydia
(klamydia) og Pseudomonas. Den store udbredelse
af TTSS hos patogener kan skyldes at TTSS
kassetten kan overføres horisontalt mellem arter.
Som eksempel vil jeg bruge bakterien Shigella.
Den mest almindelige årsag til shigellainfektion er
forurening af mad med fækalier. Efter man har
spist inficeret mad eller vand vil bakterien
invadere sin vært gennem epitelceller i tyktarmen
ved hjælp af sit TTSS. Med dette injicerer den IpaD
protein ind i epitelcellen, der trigger den til at
optage bakterien. Denne vakuole bliver nedbrudt
af de udskilte IpaB og IpaC proteiner. Herinde kan
den nu dele sig, og ydermere kan den ved
IcsA proteinet "overtage" epitelcellens actin
polymeriseringsapparat, som den bruger til at
blive skudt rundt omkring i cellen, og ind i andre
naboceller som så bliver inficeret. I alt forårsager
Shigella ca. 165 millioner årlige tilfælde af
dysenteri, og ca. 1 million dødsfald - næsten
udelukkende i udviklingslande
Opslag
