Johanne Schmidt-Nielsen og Naser Khader nøgne

Vores karikaturtegner Ole Olsen har stukket huld på en kreativ byld og her ses resultatet.

Naser Khader, folketingsmedlem for mange forskellige partier, ses her nøgen på vej til arbejde på borgen.


Og her ses Johanne Scmidt-Nielsen, folketingsmedlem fra Enhedslisten, nøgen.


Artikelpræsentation

Præsentation af artiklen ”Identification of Yersinia
enterocolitica genes affecting survival in an animal
host using signature-tagged transposon mutagenesis.”
Andrew J. Darwin & Virginia L. Miller, 1999.


Indledning
Jeg vil her gennemgå de væsentligste pointer fra
den ovenstående artikel fra det velansete
tidsskrift Molecular Microbiology.
Først vil jeg komme med baggrunden for at
undersøgelsen blev udført, hvad forfatternes
formål og hypotese var, hvordan de gjorde, hvad
de fandt ud af og slutteligt vil jeg kommentere
resultaternes betydning.
Baggrund
Tre arter af Yersinia slægten, en Gram-negativ,
stavformet og fakultativ anaerob enterobakterie,
er patogene for mennesker. Disse tre arter er Y.
pestis, Y. pseudotuberculosis og Y. enterocolitica
og de er forbundet med både lokale og systemiske
infektioner. Det er den sidste af disse bakterier
forfatterne her beskæftiger sig med, men
resultaterne er dog sigende for alle tre arter. Man
har tidligere identificeret et 70kb virulensplasmid
hos Yersinia, kaldet pYV, der kan findes i alle tre
arter. Generne på dette plasmid koder for mange
virulensfaktorer såsom type III sekretionssystem
(TTSS) (omtales senere) samt effektorproteinerne
til sekretion. Det er dog vist at pYV ikke er alene
om virulensen, men at der også er kromosomale
gener involveret. Bland andet er der gener der
koder for adhæsion og indtrængen i værtscellen,
binding af jern (siderophorersyntese) samt
syntese af lipopolysakkarid O-antigen.
Formål og hypotese
Efterhånden som sekvensering af hele genomer er
blevet lettere, har man genetisk kortlagt flere
patogene bakterier. Dog mangler man stadig
megen indsigt i hvilke gener der koder for hvilke
proteiner, og i særdeleshed hvilke gener der er
involveret i bakteriers virulensmønster.
Grundet besværligheder med at skulle teste hver
enkelt mutants virulensegenskaber og tilhørende
gener i et testdyr, havde det på daværende
tidspunkt ikke tidligere været muligt at lave
storskalaforsøg, der skulle kortlægge netop dette
for hele genomer. Det kan man nu ved hjælp af
signature-tagged mutagenesis (STM). Her vil
forfatterne lave en lang række mutanter, og en del
af disse vil være med forringede virulensegenskaber,
simultant teste flere stammer i en
enkelt vært, og derefter finde ud af hvilke gener
der i det givne tilfælde er forstyrret.
De forventer fra forsøgets start at en række af
deres mutanter vil være muteret i pYV, og at disse
vil have kraftigt forringet virulens. Derudover
håber de at opdage gener på kromosomet der
enten ikke er kendte, eller ikke er kendte i
forbindelse med virulens og overlevelse i vært.
Metode
En række signature-tagged mutanter blev
fremstillet med ved at pUT vektoren indeholdende
mini-Tn5 Km2 transposonet blev indsat i E. coli
stammen CC118, og derefter overført til Y.
enterocolitica stammen JB580v via konjugation.
Disse mutanter blev screenet for insertion af det
omtalte transposon ved ampicilin selektion
(forskellig koloniseringsmønster med og uden
insert) og der blev udført Southern blot på 18
tilfældige prøver hvor der blev screenet for
kanamycinresistens, som sad på transposonet.
Indledende undersøgelser viste at den bedste
infektionsmetode på testdyrene (6-7 uger gamle
BALB/c hunmus) var intraperitoneal (IP) injicering
(direkte injicering i bughule), med ca. 107 colonyforming
units (cfu), efterfulgt af opsamling fra
milten efter 48 timer.
For at undgå at injicere med svækkede auxotrofe
bakterier, blev der selekteret transposonmutanter
dyrket på minimalmedie.
STM
Metoden til at screene for svækkede bakterier
blev som nævnt gjort med signture-tagged
mutagenesis (STM). STM er en negativ
selektionsmetode hvor de her i forsøget bruger
deres pulje af mutanter (21 puljer af 96 mutanter)
til at inficere grupper af tre mus. Det specielle ved
STM er, at det indsatte DNA har et specielt
signaturmærke, et signature tag, som er en lille
velkendt sekvens der efterfølgende kan findes ved
Southern blot hybridicering. I den indledende
screening inficeres musene og bakterier opsamles
fra milten. Disse blandes og overføres til 96
kammers mikrotitterplade. Herefter screener man
med proper på originalbakterierne (input – alle
originale mutanter) og de der var at finde i milten
(output - de overlevende). På den måde kan man
finde de svækkede bakterier ved deres manglende
tilstedeværelse i de fra milten opsamlede
bakterier (negativ selektion), hvilket ses som
manglende eller svag hybridicering i forhold til det
fra input (første del af fig. 1 fra artiklen). Herefter
tog man de mutanter der udviste manglende
hybridicering – altså svækket virulens, og kørte
secondary screening med samme procedure som
før, men med dobbeltbestemmelse (2x3 mus).
Hermed skulle man mindske risikoen for at udtage
mutanter der reelt ikke var svækkede (anden del
af fig. 1 fra artiklen).
Efterfølgende blev svækkede mutanter undersøgt
og klassificeret fænotypisk og ved kloning
efterfulgt af sekvensering, og der blev udført
konkurrence- og vækstassays.
Resultater
På baggrund af de to indledende STM screeninger
fandt de frem til 68 mutanter med svækket
virulens. Som forventet ville en del af disse være
muteret i pYV, og det blev da også fundet at 29
var pYV mutanter. Dette blev undersøgt ved
vækstmønster på LBMOX plader og kanamycinsensitivitet.
Dvs. at der ud af de oprindelige 68
mutanter var 39 der havde mutationer i
kromosomale virulensgener. Ud af disse blev der i
16 tilfælde observeret den samme fænotype
(aggregering i flydende medie samt uklar vækst på
LB agar plader) som skyldes en defekt i LPS
syntesen, og dermed syntesen af O-antigen, som
er essentiel for Y. enterocoliticas virulens. Altså
var der nu 23 mutanter tilbage, hvor mutationen
sad et andet sted end i pYV eller LPS syntese
generne. For at konfirmere hvorvidt de reelt var
svækket undersøgte man alle 68 i et konkurrence
assay i mus, hvor man målte om bakterierne
klarede sig dårligere end vildtype Y.
Enterocoliticas. Af denne test fandt man at 10 af
de 23 var reelt svækket og samlet set var 55 af de
68 reelt svækket. Dette i deres øjne gode resultat
tilskriver de den dobbelte STM screenings
procedure.
Ved pYV mutanterne var det især i type III
sekretionsgenerne at insertet var at finde og i
særdeleshed i lcrV og yscL, dette kunne tyde på et
’hot-spot’ for insertion af transposonet mini-Tn5
Km2 netop her (fig. 2 fra artiklen).
Af de 16 med formodning om mutation i LPS / Oantigen
synteseapparatet, blev dette verificeret
ved sekvensering (fig. 2 fra artiklen).

De sidste 10 kromosomale mutanter blev ligeledes
ved kloning og sekvensering undersøgt. Her fandt
man insertet, og dermed forstyrrelsen, i gener der
kodede for ydre membransyntese (yifH og nlpD),
næringsoptag/erhvervelse (pstC og irp1) og stress
respons (dnaJ). De sidste 5 havde mutationer i
gener homologe til E. coli gener der koder for DNA
topoisomerase I (topA), phage shock protein
operonet (pspC) og to blev fundet med
mutationer i yibP, et gen med ukendt funktion i E.
coli. Til sidst fandt man en mutation i en sekvens
der ikke gav noget resultat i GenBank databasen.
(Fig. 2 fra artiklen).
NB. I artiklen laver de en rekonstruktion af pspC
mutanten for nærmere undersøgelse. Dette vil jeg
forklare i forbindelse med spørgsmål 3 senere.
Diskussion
De fik med dette forsøg vist at STM teknikken kan
bruges til at identificere en række gener i Y.
enterocolitica med mere eller mindre betydning
for dens virulens. De fik reidentificeret en række
essentielle virulensgener i pYV (type III
sekretionssystem) og i LPS syntesegenerne på
kromosomet. Resultaterne fra de kromosomale
mutanter mindede om tidligere STM resultater fra
de patogene Gram-negative bakterier Salmonella
typhimurium og Vibrio cholera hvor man også
fandt at bakterier med mutationer i gener
involveret i O-antigensyntesen, stress respons og
næringsoptag/erhvervelse havde svækket
virulens. Det mest opsigtsvækkende de fandt ud
af, var at genet pspC, homolog til det gen der i E.
coli er en del af phage shock protein operonet,
havde betydning for Y. enterocoliticas’s virulens.
Denne mutant udviste meget ringe virulensgrad i
testdyret, men voksede fint in vitro. Dette gen har
i E. coli ingen kendt funktion, men man ser en øget
ekspression ved ekspression af sekretinproteiner,
der bl.a. bruges i type III sekretionssystemet. Altså
en formodet sammenhæng til vigtige virulensgener.
Der skal dog forskes yderligere i denne
sammenhæng for at forstå betydningen af pspC
genet og dets virulensfunktion.
Artiklen har den betydning, at den viser at en lang
række virulensgener kan identificeres ganske
hurtigt og relativt simpelt ved STM metoden.
Dette betyder at andre patogene bakterier, Grampositive
såvel som Gram-negative, hurtigt kan
screenes for virulensgener, hvilket kan have stor
betydning for sygdomsbehandling, lægemiddeludviklingen
og vores generelle kendskab til
patogene bakterier.
Derudover er det brugbart i forbindelse med at
flere og flere organismers (især bakterier) genom
sekvenseres, og at der er behov for at forstå
betydningen af de enkelte gener i den undersøgte
organisme.
Generelt virker artiklen vellavet i forhold til
forsøgenes opbygning, reproducerbarhed og den
generelle struktur i artiklen.

Specifikke spørgsmål
Spørgsmål 1:
Signature-tagged mutagenesis (STM) er en teknik
der bruges til at undersøge geners funktion in
vivo. Man laver et transposon med en velkendt
signatursekvens, som så overføres til den
organisme der skal undersøges oftest via E. coli.
Transposonet, med signaturtagget, sætter sig et
tilfældigt sted i genomet eller i et plasmid, og vil
dermed med stor sandsynlighed forstyrre og
ødelægge det gen og dermed det translaterede
protein. I STM har hver enkelt transposon sin egen
unikke signatur, og kan derfor efterfølgende
findes ved DNA probehybridicering (Southern
blot). Til forskel fra almindelig random transposon
mutagenesis (RTM) hvor man for hver enkelt
mutation skal bruge et testdyr til negativ kontrol,
kan man her bruge en hel pulje (i artiklens tilfælde
bruger de 96 pr. testdyr) og finde en specifik
svækket mutant. I det originale design af STM som
blev udformet af Hensel et al.1 brugte man som i
forsøget her hybridiseringsprober, nu kan en
anden metode med PCR detektion, udviklet af
Lehoux et al.2 bruges. Her er ideen at hver enkelt
tag amplificeres med tag-specifikke primere.
Tilstedeværelsen af et PCR produkt fra et tag i
input pool og fraværet af samme PCR produkt fra
output pool viser tabet af den specifikke mutant
under den negative selektionsscreening.
Fordelene ved STM med begge signature-tag
detektionsmetoder er således klare, da man både
sparer tid (og dermed penge) og testdyr. Egentlige
ulemper i forhold til RTM har jeg svært ved at
finde.
Spørgsmål 2:
I artiklen dobbeltscreener forfatterne deres
mutanter. Dette gøres ved at lave prober der er
lavet til at hybridisere til det indsatte transposon
(baseparringsprincip). Når man udtager bakterier
fra musens milt vil de bakterier der er at finde der,
være de som er i stand til at inficere musen, altså
de bakterier vi ikke ønsker at undersøge. Men hvis
man finder de bakterier der, så at sige, mangler
kan man så finde det gen der er forstyrret ved at
se på input poolen. Dette gør de for at det
primært er svækkede bakterier de injicerer, og på
baggrund af denne dobbeltscreening opnår de et
resultat der hedder at 55 af de oprindelige 68
mutanter reelt var svækkede, hvilket svarer til
81%. Dette er en forbedring i forhold til tidligere
resultater, hvor kun 45% af de screenede
mutanter var reelt svækkede (her screenede man
Vibrio cholera).
1 Hensel M, Shea JE, Gleeson C, Jones MD, Dalton E, Holden DW:
Simultaneous identification of bacterial virulence genes by negative
selection. Science 1995, 269:400-403.
2 Lehoux DE, Sanschagrin F, Levesque RC: Defined oligonucleotide tag
pools and PCR screening in signaturetagged mutagenesis of essential
genes from bacteria. Biotechniques 1999, 26:473-478, 480.
Spørgsmål 3:
I forsøget vil de fastslå om de fænotypiske
ændringer skyldes transposon mutagenesen eller
om der er tale om en spontan mutation. I alle på
nær en enkelt mutant kan de dog udelukke
spontan mutation. Undtagelsen er i homologen til
E. coli genet pspC. Derfor konstruerer forfatterne
tre nye pspC mutanter i samme stamme af Y.
enterocolitica. Den ene nye mutant skulle være en
kopi af den mutant fra det oprindelige forsøg,
mens de to andre skulle være mutanter med en
insertion-deletion i genet, med en kanamycinresistens
kassette. Kopien blev lavet ved at det
indsatte fragment fra originalen blev opformeret
ved PCR og ligeret ind i en vektor og overført til Y.
enterocolitica ved konjugation. De to andre blev
lavet ved at kanamycin-resistens kassetten blev
indsat i to forskellige orienteringer ved ligering. Af
disse tre nye bakterier blev der igen foretaget et
konkurrenceassay. Resultaterne af dette assay
med de rekonstruerede mutanter ses i tabel 3 i
artiklen, og det ses i sammenligning med pspC
resultatet fra det første konkurrenceassay (tabel
2) at resultaterne er meget identiske - mutanterne
inficerer musene i ringe grad, men gror fint in
virto. De fastslår derfor, at mutationer i pspC
homologen i Y. enterocolitica væsentlig svækker
dens virulens.
Spørgsmål 4:
Type III sekretionssystemet (TTSS) er en kompleks
transmembran proteinstruktur der findes i mange
Gram-negative bakterier, patogene og nonpatogene.
Hos de patogene bruges det især til at
udskille proteiner der hjælper bakterien med at
inficere sin vært, og der er derfor kraftig
sammenhæng mellem virulens og tilstedeværelsen
af TTSS. Hallmarket i systemet er nålen.
Den sidder forankret først til den indre membran i
den indre membranring, via en connector over
peptidoglykanlaget til den ydre membranring
hvorefter den har krydset hele bakteriens
vægsystem. Selve nålen er hul, med en diameter
på ca. 3 nm, hvilket betyder at de fleste effector
proteiner skal udskilles i udfoldet tilstand. (se fig.
1 nedenfor)
Figur 1. Skematisk tegning af TTSS. Fra Wikimedia Commons
Tidligere mente man, at selve nålen var i stand til
at perforere værtscellerne, men dette billede er
nu ændret. Nu er teorien at den udsender
proteiner kaldet translocators, der danner en pore
i værtens cellemembran, hvorigennem andre
effektorer kan strømme.
I artiklen bliver transposonet i en af mutanterne
indsat i en sycT-yopM gen region, og dette
formoder de kan affektere gener der er involveret
i TTSS . De undersøger om det er på grund af fejl i
udskillelsen af såkaldte Yop proteiner (Yersinia
outer proteins), som er med til at perforere
værtscellerne, der er årsag til den svækkede
virulens. Derfor undersøgte de proteinsammensætningen
i vækstmediet for de omtalte
mutanter, og sammenlignede med vildtype (fig. 2).
I det forsøg fandt de ingen synlig forskel i
proteinbilledet for mutanterne og vildtypen.
Spørgsmål 5:
Der findes mange bakterier der bruger TTSS i
forbindelse med deres virulens. Af disse arter kan
nævnes Shigella (bacillary dysenteri), Salmonella
(tyfus), Escherichia coli (madforgiftning),
Burkholderia (glanders), Yersinia (pest), Chlamydia
(klamydia) og Pseudomonas. Den store udbredelse
af TTSS hos patogener kan skyldes at TTSS
kassetten kan overføres horisontalt mellem arter.
Som eksempel vil jeg bruge bakterien Shigella.
Den mest almindelige årsag til shigellainfektion er
forurening af mad med fækalier. Efter man har
spist inficeret mad eller vand vil bakterien
invadere sin vært gennem epitelceller i tyktarmen
ved hjælp af sit TTSS. Med dette injicerer den IpaD
protein ind i epitelcellen, der trigger den til at
optage bakterien. Denne vakuole bliver nedbrudt
af de udskilte IpaB og IpaC proteiner. Herinde kan
den nu dele sig, og ydermere kan den ved
IcsA proteinet "overtage" epitelcellens actin
polymeriseringsapparat, som den bruger til at
blive skudt rundt omkring i cellen, og ind i andre
naboceller som så bliver inficeret. I alt forårsager
Shigella ca. 165 millioner årlige tilfælde af
dysenteri, og ca. 1 million dødsfald - næsten
udelukkende i udviklingslande

Nekrolog: En skøn fugl er for evigt død, madagaskar snepen

Den yderst sjældne fugl Madagaskars alaotra-lappedykker er af eksperter blevet erklæret for uddød. Ja kære læser, du hørte rigtigt, uddød. Det er et faktum vi ornitolog-nekrologer er ganske glade for, nu kan vi så skrive en lille tekst. Men det er nu en skam for os alle. Hvil i fred kære Madagaskars alaotra-lappedykker, Tachybaptus rufolavatus.

Ornitolog-nekrolog Tøger Torkel, cand. cons.

læs mere på Politiken

Syre-base titrering. Indstilling af saltsyre

Formål

Bestemmelse af koncentrationen af saltsyre i en ukendt opløsning, ved indstilling overfor en urtiter substans (primær standard).

Metode

En kendt mængde af Tris, med en kendt koncentration, titreres med den ukendte opløsning af HCl.

Teori

Et mol saltsyre reagerer med et mol Tris. Analyserne med saltsyre har en molaritet på mellem 0,08 og 0,12 M, og herudfra har vi beregnet det omtrentlige omslagspunkt til at være ved 16,5 ml tilsat HCl (ud fra den oplysning, at forholdet mellem stofmængden af Tris og HCl er 1:1 og at saltsyrens koncentration gennemsnitligt er 0,1 M).

Reaktionsligninger

Stofligning:

(HOCH2)3C-NH2 (aq) + HCl (aq) ® (HOCH2)3C-NH3+ (aq) + Cl- (aq)

Ionligning:

R-NH2 (aq) + H+ (aq) ® R-NH3+ (aq)

Resultater

Vi valgte den ukendte saltsyre nr. 4.

Grovtitrering:

- Massen af Tris: 1,5448 g1,3251 g (bakkens vægt + rest) = 0,2197 g

- Vi titrerede 15.5 ml HCl

1. nøjagtige titrering:

- Massen af Tris: 1,5109 g1,3251 g (bakkens vægt + rest) = 0,1858 g

- Vi titrerede 12.8 ml HCl

2. nøjagtige titrering:

- Massen af Tris: 1,5615 g1,3197 g (bakkens vægt + rest) = 0,2418 g

- Vi titrerede 16.9 ml HCl

Beregninger

Vi beregner koncentrationen af den ukendte saltsyreopløsning:

Grovtitrering:

Vi beregner først n(tris):

Som nævnt tidligere reagerer saltsyre og tris 1:1, så

n(tris) = n(HCl) = 0,0018 mol

Så koncentrationen af saltsyre bliver da:

1. nøjagtige titrering:

Vi beregner først n(tris):

Så koncentrationen af saltsyre bliver da:

2. nøjagtige titrering:

Vi beregner først n(tris):

Så koncentrationen af saltsyre bliver da:

Gennemsnit af de 3 bestemmelser:

Diskussion

Vores forsøg var meget vellykket. Grovtitreringen tydede på, at vi havde en saltsyre med koncentrationen på 0,12 M. Og efter at have lavet to nøjagtige titreringer, fik vi underbygget antagelsen, og vi konkluderer dermed, at vores ukendte saltsyre (IV) har koncentrationen 0,12 M.

Øvelse 3.b: Syntese af jern(II)sulfat heptahydrat

Formål

Fremstilling af jern(II)sulfat heptahydrat FeSO4×7H2O.

Metode

Jern-søm opløses i svovlsyre under hydrogenudvikling og dannelse af jern(II)sulfat i opløsning.

Teori

Jern er mindre elektronegativt end hydrogen, og derfor vil der blive dannet jern(II)-ioner i opløsningen med svovlsyre. Vi bruger et overskud af jern, som bevirker fældning af metaller, der er mere elektronegative end jern, samt hindrer oxidation af Fe2+ til Fe3+.

Reaktionsligninger

Ionligning:

Fe (s) + 2 H+ (aq) → Fe2+ (aq) + H2 (g)

Stofligning:

Fe (s) + H2SO4 (aq) + 7 H2O (l) → FeSO4 ×7 H2O (s) + H2 (g)

Følgende reaktion vil forløbe ved oxidation med luftens oxygen:

2 H2O (l) + 4 Fe2+ (aq) + O2 (g) + 8 OH- (aq) → 4 Fe(OH)3 (s)

Resultater

Massen af jernsøm: 4,95 g

Mængde tilsat svovlsyre: 4 ml

Udbytte af jern(II)sulfat heptahydrat: 12,88 g

Beregninger

Fe (s)

+

H2SO4 (aq)

+

7 H2O (l)

FeSO4 ×7 H2O (s)

+

H2 (g)

m

4,95 g

20,02 g

M

55,85 g/mol

278,022 g/mol

n

0,0886 mol

0,072 mol

0,072

V

4 ml

c

18 M

Som man kan se, er svovlsyren den begrænsende faktor.

Det teoretiske udbytte er: 20,02 g.

Udbytteprocenten:

Diskussion

Som det ses, har vi fået en forholdsvis lille udbytteprocent. Dette skyldes hovedsageligt, at reaktionen ikke nåede at løbe til ende, for da vi stoppede kogningen var der stadig stor hydrogenudvikling omkring sømmene, og vi tror, at hvis vi f.eks. havde givet det en halv til hel time mere, så var der blevet dannet en del mere FeSO4×7H2O. En anden lille fejlkilde er, at man under forsøget (specielt filtreringen) kan miste lidt af stoffet.

Øvelse 3.c: Reagensglasforsøg

1. forsøg

- 4 M NH4Cl:

pH aflæses til ca. 5.

Reaktionsligninger:

NH4Cl (aq) → NH4+ (aq) + Cl- (aq)

NH4+ (aq) + H2O (aq) NH3 (aq) + H3O+ (aq)

pH beregnes til:

Som det ses er der ikke stor afvigelse mellem målt og beregnet pH værdi.

- 2 M NH3:

pH aflæses til ca. 11.

Reaktionsligning:

NH3 (aq) + H2O (aq) NH4+ (aq) + OH- (aq)

pH beregnes til:

pH værdierne er meget tæt, taget i betragtning at det højeste vi kunne måle med indikatorpapir var 11.

2. forsøg

Vi så hverken farveskift eller bundfald, men der skete en gasudvikling, og vi målte pH i gassen til 11.

Ionligning:

NH4+ (aq) + OH- (aq) → NH3 (g) + H2O (l)

Stofligning:

NH4Cl (aq) + NaOH (aq) → NH3 (g) + H2O (l) + NaCl (aq)

Når vi så måler at gassen har en pH på ca. 11, passer det jo meget godt med, at det er ammoniak på gasform der bliver dannet.

3. forsøg

Farveskift: klar lyseblå → blå (uklar/grumset) → mørkeblå (klar)

Bundfald: 1 dråbe NH3 medfører mørkeblåt bundfald, og 6 dråber opløser bundfaldet.

Reaktion:

Når kobber(II)sulfat opløses. Kobberionen er (lyse)blå i vand:

CuSO4 (s) ® Cu2+ (aq) + SO42- (aq)

Ammoniak er en svag base:

NH3 (aq) + H2O (l) NH4+ (aq) + OH- (aq)

Tilsætning af ammoniak til kobber(II)sulfat giver først et bundfald af blåt kobber(II)hydroxid:

Cu2+ (aq) + 2 OH- (aq) Cu(OH)2 (s) (*)

Ved overskud af ammoniak dannes den dybt mørkebå kompleksion tetraamminkobber(II)-ion:

Cu2+ (aq) + 4 NH3 (aq) Cu(NH3)42+ (aq)

Herved forskydes ligning (*) til venstre, kobber(II)hydroxidet opløses, og der fås en meget mørkeblå opløsning:

Cu(OH)2 + 4 NH3 (aq) Cu(NH3)42+ + 2 OH-

4. forsøg

Farveskift: klart → mælkehvidt → klart

Bundfald: 1 dråbe NH3 medfører hvidt bundfald, og 7 dråber medfører at bundfaldet opløses.

Når zinksulfat opløses:

ZnSO4 (s) ® Zn2+ (aq) + SO42- (aq)

Tilsætning af ammoniak til zinksulfat giver først et bundfald af hvidt zinkhydroxid:

Zn2+ (aq) + 2 OH- (aq) Zn(OH)2 (s) (*)

Ved overskud af ammoniak dannes den komplekse ion tetraamminzink(II)-ion:

Zn2+ (aq) + 4 NH3 (aq) Zn(NH3)42+ (aq)

Herved forskydes ligning (*) til venstre, zinkhydroxidet opløses, og der fås en klar opløsning:

Zn(OH)2 (s) + 4 NH3 (aq) Zn(NH3)42+ + 2 OH- (aq)

Sumpskildpadder i Danmark - biologirapport

Formål

Der er blevet observeret Europæiske sumpskildpadder (Emys orbicularis) i Danmark, nærmere bestem ved Salten Å (vi kigger på to herfra) og i Igelsø. Spørgsmålet som rejser sig er så, hvorfra kommer disse? Vi er blevet præsenteret for to teorier, men en tredje eksisterer:

1. En naturvejleders overbevisning om at sumpskildpadden har overlevet i Midtjylland, og ikke er uddød for 2000 år siden, som ellers antaget. De skulle efter hans udsagn være en lille population, af den oprindelige danske (Nordeuropæiske) underart. Denne overlevelse skulle ske uden egentligt beskrevne observationer.

2. At det er købte kæledyr som enten er sat ud i få eksemplarer, eller at de systematisk er blevet sat ud, slægten skulle så være af de fra Balkanområdet, nærmere bestemt Serbien og Ukraine, da det er disse man kan købe i dyrehandlere.

3. En tredje teori, som vi dog ikke får direkte beskrevet, er den at det er en ny underart, eller race, af de udsatte som på de år der skulle være sat dyr ud (hvilket ikke kan være mere end 100 år, hvis overhovedet) skulle have evolutioneret sig til en underrace. Dette ville kun kunne forekomme hvis individet muterede, dette er sandsynligt, men sandsynligheden må siges at være så lille at denne teori, uden videre kan forkastes.

Man kan sige meget om den første teori, hvis jeg skal komme med en kommentar, ville jeg umiddelbart kalde det for pop-biologi, da denne teori vækker stor medieinteresse, men ikke umiddelbart har det store i sig. Da denne naturvejleder som vi bliver præsenteret for ikke kommer med nogen konkrete beviser, men bare en masse indicier og postulater. Dog kan man sige at den er blevet bredt accepteret, eksempelvis kan det nævnes at på et ellers så informativt online leksikon som wikipedia, kan man læse; ”Europæisk sumpskildpadde (Emys orbicularis) blev genopdaget i Danmark, Midtjylland i 1997.” Her må man sige at de antyder, at det ikke bare er nogle få udsatte eksemplarer, men en egentlig population.

Vores formål med denne øvelse er så, at fastlægge, hvorfra disse observerede skildpadder egentlig er fra. Vi har DNA fra Salten Å, Polen, Ukraine, Grækenland og Serbien. Hvis deres DNA matcher med dem fra Balkanområderne, må man konkludere at de er udsatte, hvorimod, er de forskellige kan man sige at de er overlevende eksemplarer fra den 2000 år gamle Midtjyske underart.

Teori

Der er en del teoretisk stof, som skal frem her, så jeg har valgt at opdele det i disse 4 underemner:

· Europæisk sumpskildpadde:

Den Europæiske sumpskildpadde, Emys orbicularis er en skildpadde som findes i Syd- og Centraleuropa, Vest Asien og Nord Afrika, men da denne har så store udbredelsesområder beskriver man ofte den europæiske som en undeart ved navn Emys orbicularis orbicularis for at kunne skelne mellem den og en anden også udbredt underart Emys orbicularis orientalis.

Den lever i langsomt rindende vand, og overvintrer i op til 7 måneder. Den ligger æg, som mange andre krybdyr, og for at disse skal kunne udklække, skal sommerens varmeste måneds gennemsnitstemperatur være over 18 °C.

· Elektroforese og restriktionsenzymer:

En elektroforese er en slags sining af DNA-stykker. Men før man kan gå i gang med elektroforesen, skal man ha klippet sit DNA i stykker. Til dette bruger man restriktionsenzymer, der er specielt designet til at klippe efter en speciel kode. De enzymer vi brugte hedder ECO R1 og PST R1, og disse klipper henholdsvis ved G eftf. af AATTC og ved CTGCA eftf. af G, dette ser således ud:

Når man har klippet DNA’et i mindre stykker tilsætter man en tung markørbuffer, så man senere i forsøget kan se, hvor langt DNA-stykket er vandret.

Gelen, den såkaldte si, er lavet af agarose, deioniseret vand og gel buffer. Agarose er som navnet antyder et sukker (kulhydrat), som er udvundet af japanske rødalger. Mængden af agarose afgør hvor tæt ”filtret” bliver, har man små sekvenser af DNA ønsker man et tæt filter, og man tilsætter derfor meget agarose. Da vi skulle fremstille den opløste vi 0,5 gram agarose i 50 mL TAE buffer (se nedenstående), og opvarmer denne i mikrobølgeovn så de to substanser smelter sammen. Derefter hældes den stadig flydende gel ned i karret hvor den størkner.

Når man har afsat sit DNA materiale i gelen sætter man strøm til hver ende af badet. I den ene ende er anoden (positiv elektrode) og i den anden er katoden (negativ elektrode). Man har vendt gelen sådan, at den ende man har afsat miks i vender væk fra anoden. Dette er fordi DNA-molekylerne er negativt ladede, så de vil vandre mod anoden. Vandringen gennem gelen foregår i forskellige tempi afhængigt af molekylets størrelse. Jo større molekylerne er jo langsommere bevæger de sig gennem gelen. Grunden til man har tilsat markørbufferen, er at den altid vil bevæge sig hurtigere end nogle af DNA-molekylerne, så når markøren er kommet ned til den anden ende slukker man for strømmen.

· PCR, farvemarkøren og TAE bufferen:

Et enkelt kritisk problem i dette forsøg er mængden af DNA materiale, for at kunne lave en ordentlig elektroforese, som skal give et realistisk billede, har man brug for meget DNA materiale. Har man ikke det, kan man bruge en molekylærbiologisk opformeringsmetode som kaldes PCR, Polymerase Chain Reaction (Polymerase kæde reaktion) som blev opfundet så tidligt som 1983 af Kary Mullis, som 10 år senere modtog Nobels Kemipris for netop denne opdagelse. Som navnet antyder, er det en kunstigt fremstillet replikationsmetode. Den er relativt simpel, jeg har prøvet at illustrere det i nedenstående figur:

· Trin 1: DNA’et hældes ned i en beholder, sammen med polymerase og frie nucleotider.

· Trin 2: Hele substansen opvarmes til lidt over 65 °C, (på BIO RAD maskinen er det nærmere 90 °C) ved denne temperatur brydes hydrogenbindingerne mellem nucleotiderne i DNA’et nemlig. Og der er ingen risiko for at skade nucleotiderne da disse først smelter ved +300 °C

· Trin 3: Substansen nedkøles igen til under 65 °C, hvorefter de frie nucleotider har sat sig på de frie pladser i DNA’et, og man på denne måde nu har fremstillet 2 ens DNA strenge, denne sekvens kan gøres igen, og hver gang fordobles antallet af DNA stykker.

Den farvemarkør jeg nævnte i teoriafsnittet om elektroforese, skal som sagt angive hvor langt DNA stykkerne er nået i gelen, de skulle jo nødig vandre helt igennem den. Dette forudsætter at stykkerne i markøren er mindre end de mindste DNA stykker. Men det er også lavet sådan i vores forsøg, så markøren har en hastighed på 500bp, som svarer til en sekvens på 500 basepar. De streger denne markør laver, vil kunne ses med det blotte øje, så man som sagt ved hvornår man skal slukke.

TAE-bufferens (Tri-Acetat-x) essentielle rolle er at holde DNA’ets pH stabilt på 7.6. Dette skal gøres fordi en pH værdi på 7,6 sikrer at DNA’et forbliver negativt ladet. Billedet til højre viser AMP Adenosine monophosphat, som er en nucleotid, og man kan se den negative ende med O-.

· Størrelsesmarkøren:

I dette forsøg er det vigtigt at kunne sammenligne størrelsen på de udskårne DNA stykker, så for at have en reference bruger man en såkaldt størrelsesmarkør, som i dette tilfælde er en DNA-størrelsesmarkør. Det DNA vi brugte stammede fra en virus, og vi må formode at det er en virus som forskere har bestemt hele dens genom, og derfor alle basesekvenser. Så da vi kender størrelsen på alle fragmenterne, og måler på hvor langt de er vandret i gelen, kan vi lave en graf i et enkeltlogaritmisk koordinatsystem. Dette viser antallet af basepar op ad 2. aksen, og antal vandrede mm. i gelen, ud af 1. aksen. Resultatet ses i afsnittet: ”resultater”.

Metode

jf. øvelsesvejledningen.

Fejlkilder

Under forsøget kom vi til at hælde TAE bufferen ned i røret til sidst. Af den grund blev vores DNA-prøver en smule udtværet. Men dette ændrede ikke på resultatet, som i sidste ende blev det bedste, set i forhold til de andre gruppers. En fejl er det, men måske en forbedrende én af slagsen.

En anden mulig fejlkilde, som dog ikke er dokumenteret, kunne være at gelen ikke er fuldstændig homogen, men at koncentrationen af sakkarose kunne være bare en brøkdel større i nogen områder af gelen, dette ville så føre til udsving i vandringen.

Resultater

Jeg har valgt at bruge fabrikantens (BIO-RAD) billede af gelen, da dette vil give de mest korrekte resultater.

1: Størrelsesmarkør

2: Salten 1

3: Salten 2

4: Polen

5: Ukraine

6: Grækenland

7: Serbien

Her ses resultatet fra regressionen over vores virus-DNA:

Den blå linie som ses, er eksponentiel regression, og den funktion man får ud af den er tegnet med tynd stiplet linie.

Jeg har så lavet en forskrift, så man kan udregne antal basepar ud fra antal vandrede mm. Jeg har dog valgt at udelukke det første punkt med 23.130 basepar, da denne afviger fra den ellers rette linie i det enkeltlogaritmiske koordinatsystem, men med de andre resultater kommer forskriften til at se således ud: , hvor f(x) er antallet af basepar, og x er antal vandrede mm. Ud fra denne model, og de målte afstande fra gelen, kan man opstille et skema, som viser de forskellige bånds basepar for de forskellige skildpadders DNA:

Salten 1

Salten 2

Polen

Ukraine

Grækenland

Serbien

3648

2820

2970

3821

3189

2969

2969

1112

1773

3078

2620

2070

740

862

1117

740

1061

1116

Diskussion

Kigger man på skemaet over sumpskildpadder og deres basepars størrelser, kan man relativt nemt fastslå, at skildpadden ”Salten 1” er udsat, og at den oprindeligt stammer fra den Ukrainske underart. Den største forskel i basepar mellem de to, er på 173 basepar. Man må sige at det er relativt lidt, da 173 basepar næsten ingenting er, og vi fastslog at der var en usikkerhedsmarkør på ca. 100-200 basepar. Når vi så ser på Salten 2 ser det straks værre ud. Den har ingen umiddelbare ligheder med nogen af de andre. Dette er en kraftig indikation at den stammer fra den oprindelige nordeuropæiske underart, som ellers var regnet for uddød for 2000 år siden. Men man må sige til resultatets forsvar, at hvis bare populationen er lille nok, vil den have været meget svær at få øje på i den vilde natur. Skildpadden overvintrer som sagt i 7 måneder, og der er ellers her vegetationen omkring søer og åer er delvist væk, således at man nemt ville kunne spotte den. Det skal også siges at det er et natdyr, og føler den sig bare det mindste truet, glider den stille og lydløst ned i vandet.

Et andet faktum som man kan se ud fra gelen, er at de alle er meget nært beslægtede, dette vidste vi dog på forhånd, men det er tydeligt illustreret i skemaet i det at de alle har en DNA sekvens omkring 3000 basepar. Nærmere bestemt er gennemsnittet af de bånd på 3016, og den største afvigelse fra dette er Grækenland med 173 basepar, og igen ligger dette inden for usikkerhedsmarkøren.

Klimanormaler for Midt- og VestjyllandVi fik indledningsvist af vide, at; ”… hvis sommerens varmeste måneds gennemsnits temperatur bliver under 18°, kan deres æg ikke klækkes” Dette faktum undersøgte jeg, og fandt fra DMI’s hjemmeside en afbildning af Midtjyllands klima fra 1961 til 1990:

Og som det tydeligt fremgår af den mørke streg som angiver middeltemperaturen har gennemsnitstemperatu-ren i den varmeste måned (juli med et gns. på 15,4° C) ikke været i nærheden af de påkrævede 18° C, så det giver et dilemma. Enten må man helt forkaste vores resultater, som ellers kraftigt tydede på at de stammede fra den oprindelige danske underart, eller også må man vælge at se bort fra det faktum, at der i en årrække på 29 år, ikke har været en middeltemperatur på 18° C.

Hvis vores restriktionsenzymer ikke havde virket ville vores gel have givet os et meget dårligt billede at arbejde med, for i og med at der ikke ville blive klippet nogen steder i DNA’et, ville det blive én meget lang basesekvens, som ville bevæge sig meget lidt i gelen, da agarosemængden er tilpasset meget mindre stykker. Derfor ville vi blot se én stor streg lige ude for brønden, og vi ville ikke kunne bruge dette resultat til noget.

Konklusion

Nu da jeg er nået til konklusionen, burde jeg have ét endegyldigt svar. Dette er bare ikke tilfældet. Jeg har to modstridende argumenter: Vælger man blot at kigge på gelen, vil jeg fastslå at sumpskildpadden Salten 1 er en udsat ”stakkel”, da dens sammensætning af DNA-sekvenser minder slående meget om den fra Ukraine, hvilket også er den man kan købe i de danske dyrehandlere. Og Salten 2, er en overlevende underart, som har levet i delvist skjul i 2000 år.

Vælger man derimod også at kigge på grafen fra DMI, ser vi her det modstridende argument. Der har i perioden 1961-1990 ikke været én juli med en gennemsnitstemperatur på de påkrævede 18°. Dette indikerer så, at det ikke er en overlevende og fødedygtig population, da den simpelthen ikke ville have nogen måneder som er varme nok til udklækkelse af dets æg.

Jeg vil dog sige, at skal dette forsøg blive en succes, må vi bortkaste argumentet med de nødvendige 18°, da dette helt spolerer det ellers så fine resultat; at der findes en overlevende vild sumpskildpadde i Danmark. Eller også skal vi vende den om, og finde en løsning på dette problem. Og en mulig teoretisk løsning på problemet kunne være, at skildpadden har været udsat for et selektionspres, som skulle forfordele evnen til at lægge æg som kan udklækkes ved lavere temperaturer, således at der simpelthen er sket en evolution i forhold til de sumpskildpadder i Sydeuropa. Dette ville give særdeles god mening.