dobbelt haploide hvedeplanter, Triticum spp

Formål

Det overordnede formål med denne øvelse er at udfærdige et genkort for en række dobbelt haploide hvedeplanter, Triticum spp. Alt dette afkom (110 planter) stammer fra krydsningen mellem de to homozygote linier CW204 og CW219.

Dag 1

De to hvedelinier var blevet krydset for at lave en heterozygot F1-plante. Fra denne plante har man taget dens haploide pollen umiddelbart inden blomstring (for at undgå selvbestøvning) og dyrket. Senere har man fordoblet kromosomtallet kemisk med colchicin, således at planterne er blevet dobbelt haploide (DH) se figur 1. Blade fra disse planter blev frysetørret og udleveret til os. Vi fik materiale fra planterne DH21,22,23 og 24. Herefter fulgte vi øvelsesvejledningen.

Spørgsmål til dag 1:

1:

	Figur 1: Krydsning af de to parentale linier og dobbelt-haploidisering. Billeder fra Wikimedia Commons.

2:

	A	A
a	Aa	Aa
a	Aa	Aa

Altså F1 er Aa. Disse segregerer i A og a, således at de nye planter (F2) efter kromosomfordobling er enten AA eller aa.

3: Vi smadrer plantematerialet mekanisk fordi cellens DNA ellers er beskyttet af flere membraner; cellevæg, cellemembran og kernemembran.

4: Ekstraktionsbufferen er en blanding af Tris-HCl, SDS og EDTA. Tris-HCl (se figur 2) stabiliserer pH. SDS (natriumlaurylsulfat, se figur 3) interfererer med de noncovalente bindinger i proteinet og får det dermed til at miste sin oprindelige form. Dermed kan disse proteiner, eksempelvis histoner, ikke binde mere og DNA’et frigøres. Det frie protein centrifugeres fra. EDTA kompleksbinder til metalioner i nukleaser således at disse ikke klipper DNA’et i smadder.

Figur 2: molekylestruktur af Tris. Kilde: ChemDraw structure of Tris fra Wikipedia.org

Figur 3: molekylestruktur af SDS. Kilde: ChemDraw structure of SDS fra Wikipedia.org

5: DNA’et vil udfælde i isopropanolen (se figur 4) og bundfælles ved centrifugering.

Figur 4: molekylestruktur af isopropanol (propan-2-ol). Kilde: ChemDraw structure of isopropanole fra Wikipedia.org

6: DNA’et beskyttes ved at EDTA i TE bufferen binder metalioner. TE-buffer består af Tris (en pH buffer) og EDTA (se figur 5). Tris sørger for at pH er konstant ved ca. 8, hvilket medfører at phosphatgrupperne er deprotonerede, og negativt ladede. Den positive side af H₂O molekyler tiltrækkes derfor og danner en ”kappe” omkring DNA-molekylet. Dette medfører at de enkelte DNA strenge skilles ad. EDTA er et molekyle der danner komplekser med nukleaser, og inaktiverer dem herved, således at DNA’et ikke klippes i stykker.

Figur 5: EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) danner kompleks med metalion. Kilde: ChemDraw structure of EDTA fra Wikipedia.org

7: Planter kan have forskellige mængder gener. En planteart med få gener er gåsemad (arabidopsis) der har ca. 27.000 gener. Man mener at de fleste planter har i omegnen af 30.000 gener.

Dag 2

Vi målte vha. NanoDrop koncentrationen af DNA i vores prøve, og lavede derefter en fortynding af vores fire planter.

Resultater

Note: Da gelbillederne fra vores eget ekstraherede DNA ikke viste nogen bånd, formodede vi at vores DNA-materiale var blevet nedbrudt. Derfor kørte vi videre med forsøget med materiale fra 2008, men samme plantemateriale.

Nedenfor ses gelbilleder fra vores forsøg:

De to billeder viser først og fremmest at der er længere DNA sekvenser i vores prøver. Derudover kan man give et skøn over størrelsen ved at sammenligne med de to størrelsesmarkører, 2-Log DNA Ladder og 100 ng Lambda DNA. På billedet kan man i toppen se et tydeligt bånd for alle prøverne, det er dette bånd vi mener, må være det største stykke sammenhængende DNA. De slørede bånd længere nede må være rester/fragmenter fra DNA, RNA eller organelDNA. Sammenligner vi vores markante bånd med Lambda DNA markøren, og en tabel over dennes bånds størrelse (s.14 i øvelsesvejledningen), skønner vi at størrelsen på vores DNA er ca. 23.000 kB (se pile).

Spørgsmål til dag 2:

1: Sammenlignet med størrelsesmarkøren skønner vi at størrelsen er 23.000 kB

2: I agarosegelen vil RNA og organelt DNA vandre væsentligt længere end vores nukleotid DNAsekvens(er) da disse er kortere, og dermed vandrer nemmere igennem agarosenettet.

3: Se figur 6:

Figur 6: Illustrationen viser i korte træk hvordan NanoDrop fungerer. Kilde: Bearbejdet fra NanoDrop

4: Den kemiske struktur for Ethidium bromid(EtBr) (figur 7):

Figur 7: Kemiske struktur af EtBr. Kilde: ChemDraw structure of Ethidium Bromide fra Wikipedia.org

IUPAC navn: 3,8-Diamino-5-ethyl-6-phenylphenanthridiniumbromid

EtBr placerer sig i rummet mellem baseparene i DNA, og på den måde fjerner det vand der ville bundet omkring EtBr. Og da EtBr er kraftigt fluorescerende i vandfrie miljøer, ses det langt tydeligere der hvor det er bundet til DNA.

5: Plasmider der er klippet (m. restriktionsenzymer), til kendte størrelser, så de kan bruges som reference.

LØ dag 3 (tirsdag d. 28. april 2009):

Prøve: 21,22,23,24 (prøver fra 2008, da vores egne ikke fungerede - formentligt var DNA’et degraderet)

1: 21 (grøn: SSR gwm120, 700nm)

2: 22 -

3: 23 -

4: 24 -

5: 21 (lilla: SSR barc128, 800nm)

6: 22 -

7: 23 -

8: 24 -

Fejlkilder: Ingen fejlkilder

Primer3 (se selvstændigt dokument)

Restriktionsenzymer: EcoRI (http://en.wikipedia.org/wiki/EcoRI) og HindIII (http://en.wikipedia.org/wiki/HindIII)

Spørgsmål til dag 3:

1: DNA’et denatureres og primer med M13 hale kobles på. DNA polymerasen syntetiserer resten af strengen ud fra den komplementære streng. Denne dobbeltstrengede DNA denatureres igen og reverseprimer bindes til komplimentærstrengen og DNA-polymerase syntetiserer en ny streng ud fra komplimentærstrengen. I denne nye streng inkorporeres M13 halen (komplimentær). Når denne denatureres og syntetiseres endnu en gang kan markørmolekylet inkorporeres, og dermed observeres. Efter dette trin kan PCR køre og markøren vil blive inkorporeret.

2: Taq er et termostabilt DNA polymerase der er fundet i Thermus aquaticus, som er en termofil bakterie.

3: Restriktionsenzymer er isoleret fra bakterier og archaea

4:

(krystalstruktur af EcoRI fra Protein Data Bank) (isoleret fra E. coli ) EcoRI klipper ved sekvensen G|AATTC og tilsvarende CTTAA|G

(krystalstruktur af HindIII fra ProteinDataBank) (isoleret fra Haemophilus influenzae) HindIII klipper ved sekvensen A|AGCTT og tilsvarende TTCGA|A

5: (se geldokument i LØ mappen)

6: Mængden af DNA er for stor til at der vil træde tydelige bånd frem på en gel.

7: (http://en.wikipedia.org/wiki/Southern_blot) (http://en.wikipedia.org/wiki/Probe_hybridization)