"The p53 gene was originally discovered in 1979 by Arnold Levine of Princeton University (now a member of HHMI's Scientific Review Board in Genetics), David Lane of the University of Dundee, Scotland (now an HHMI International Research Scholar), and William Old of the Memorial Sloan-Kettering Cancer Center in New York City. For a period of ten years, p53 was believed to be an oncogene, since the gene that the scientists worked with happened to be a mutant. But in 1989, Bert Vogelstein, Ray White (who was then an HHMI investigator at the University of Utah), and their colleagues showed that p53 is actually a tumor suppressor, and that it is altered in the majority of colon cancers. Since then, mutant forms of p53 have cropped up in so many tumors and aroused so much interest that Science hailed the p53 protein as the "Molecule of the Year" in 1993."
fra Howard Hughes Medical Institute (1996 HHMI)
Grunden til at jeg skriver dette indlæg (eller denne serie) beror i en fascination jeg har, som er, at når alt kommer til alt, består vi af celler, som alle er mere eller mindre ens, og som alle stammer fra den samme ene celle, men som alligevel udtrykkes vidt forskelligt - samt kompleksiteten af det cellulære sammenspil der finder sted, og mekanismerne i de intra- og ekstracellulære processer. Jeg kunne derfor godt tænke mig, at opsamle substantiel viden på netop dette område.
Derfor har jeg valgt at gøre rede for den mitotiske celledeling. Herunder vil jeg uddybe hvordan en cellecyklus reguleres og kontrolproteinet p53s rolle i en cellecyklus. Det vil lede mig over i kontrolproteinets rolle i udvikling af cancer, og herefter vil jeg slutte af med at vurdere udviklingen af nye behandlingsmuligheder med henblik på p53, og hvilken rolle de spiller og vil komme til at spille senere hen.
Jeg vil også indlede med at rette tak til professor Matthias Dobbeltstein fra medicinsk bioteknologisk center på SDU i Odense, da jeg har været i kontakt med ham, og han har besvaret en række spørgsmål. Han er ledende forsker og arbejder blandt andet også på universitetet i Göttingen. Denne kontakt følte jeg nødvendig da mange af de bøger, artikler og publikationer jeg har fundet allerede har nogle år på bagen, og derfor ikke helt opdaterede mht. nyeste forskning. Spørgsmålene var især rette mod fremtidige muligheder for cancerbehandling med p53.
"In the past decade, scientists have uncovered so many clues to how cancer begins—and, by inference, how it might be stopped—that, for the first time, an understanding of how to control this dreaded disease seems not just possible but almost within reach.
Many of the new clues have come from research on a topic that used to be considered quite arcane: the cell cycle, the sequence of biochemical events through which a cell grows and divides into two daughter cells. How cells divide has intrigued biologists since the beginning of the century, but only recently have scientists fathomed the complexity of the process. As a result, it has become clear that the mechanisms controlling the cell cycle play central roles in both the development and the prevention of cancer."
af W. Maxwell Cowan, M.D., Ph.D. Vice President and Chief Scientific Officer
"DNA damage, due to environmental factors and normal metabolic processes inside the cell, occurs at a rate of 1,000 to 1,000,000 molecular lesions per cell per day. A special enzyme, DNA ligase (shown here in color), encircles the double helix to repair a broken strand of DNA. DNA ligase is responsible for repairing the millions of DNA breaks generated during the normal course of a cell's life. Without molecules that can mend such breaks, cells can malfunction, die, or become cancerous. DNA ligases catalyse the crucial step of joining breaks in duplex DNA during DNA repair,replication and recombination, and require either Adenosine triphosphate (ATP) or Nicotinamide adenine dinucleotide (NAD+) as a cofactor."
Fra: Biomedical Beat National Institute of General Medical Science (NIGMS) Cool Image Gallery af Tom Ellenberger, Washington University School of Medicine in St. Louis.
Mitose
Celledelinger har en helt eksistentiel betydning for at et individ kan overleve. Et menneske består af omtrent 100 billioner celler, og det er der en god grund til. En celles overflade er nødt til at være stor i forhold til cellens rumfang, da transport af næringsstoffer i en celle foregår ved diffusion. Diffusion har en begrænset rækkevidde og næringsstoffer skal kunne nå ind i cellens indre, for at cellen skal kunne fungere. (Bremer, 1997)
Celledelinger finder sted af flere årsager: De har til formål at sørge for vækst (cellulær masseforøgelse), vedligeholdelse og formering. En organisme må bestå af mange celler for at næringsstoffer kan nå helt rundt i organismen. En organisme skal holdes ved lige, da celler let bliver beskadiget eller slidt, derfor finder der en konstant udskiftning af celler sted, hvilket kan illustreres i mange eksempler: For eksempel lever røde blodlegemer kun i ca. 100 dage, der er derfor et konstant behov for dannelse af nye røde blodlegemer i den røde knoglemarv, mavesækken indeholder saltsyre, og den lave pH-værdi slider meget på slimhinden, derfor udskiftes de ødelagte celler med nye celler dannet under det yderste cellelag i slimhinden, immunforsvaret har hele tiden et behov for at få dannet nye celler; makrofager og de forskellige lymfocytter bekæmper alle indtrængende mikroorganismer, og for at kroppen skal kunne forsvare sig overfor fremmede organismer, må der konstant dannes nye celler. Det samme gælder for det uspecifikke og passive forsvar; huden og slimhinder udskiftes hele tiden. Og disse er kun få ud af mange eksempler man kunne hive frem. Celleudskiftning har således en afgørende betydning for, at mennesket kan eksistere. (Bremer 1997 og Jensen 1999-2000)
Et menneske består af celler, som ikke deler sig, de som deler sig når der er behov for det og de som aldrig deler sig. Nerveceller menes ikke at dele sig, der er dog mistanke om, at neuroner i hjernen senere kan foretage enkelte celledelinger, men det mangler endnu at blive påvist. Leverceller deler sig normalt ikke, men når der er behov for det, så deler de sig. Celler som konstant gennemgår celledeling er stamceller i knoglemarven og forskellige cellelag i epitheler. (Prentø og Vagn Jensen 2000)
Figur 1. Diagram over normal cellecyklus. Cellecyklus har to hovedfaser: Interfase (G1, S og G2) og mitose (M). En normal celledeling varer hos mennesker 24 timer (dog med undtagelser, men her er det G1 der varierer), og de forskellige bokse repræsenterer tidslængden i relativt forhold. R er et såkaldt checkpoint. Kilde: Egen illustration, efter HHMI, W. Maxwell Cowan 1995
En cellecyklus varer oftest omkring et døgn og består af to faser: Den ene fase er interfasen, som betegnes som den periode, hvor cellen ikke deler sig (G1,S og G2). Den anden fase er mitosen (M), hvor cellen deler sig. Se figur 1. Modercellen bliver på den måde til to datterceller hvor den ene typisk vil differentiere og gå over i G0-fasen, hvilket vil blive beskrevet senere. Den anden dattercelle vil have nøjagtig de samme egenskaber som modercellen. En stamcelle kan dele sig utallige gange og beholder sin placering og egenskaber, dvs. at en stamcelle i den røde knoglemarv altid vil have den egenskab at danne røde blodlegemer. Umiddelbart ville man tro at stamceller ville være i stand til at dele sig uendeligt mange gange, men det er ikke tilfældet. Delingerne gør at DNA-replikationen ikke fungerer helt korrekt, og der vil ske en reduktion af telomerregionen, da der er fravær af enzymet telomeraseA. Det betyder, at længden af telomerregionen er afgørende for cellens levetid. Telomerernes længde er forskellige fra celle til celle og for forskellige organismer. (Prentø og Vagn Jensen 2000)
Nu gennemgås de enkelte faser i den mitotiske deling:
Interfasen
Denne fase er opdelt i tre faser som er G1-, S- og G2-fasen. Disse faser udgør tilsammen den største del af en cellecyklus tidsmæssigt (se figur 1). G1-fasen er vækstfasen, hvor de forskellige bestanddele i cytoplasmaet syntetiseres. Det er også i denne fase at de celler der ikke kan dele sig mere befinder sig i, så kaldes fasen blot for G0-fasen. Det er blandt andet nerveceller. Det gælder også celler, som kun deler sig når der er behov for det (f.eks. leverceller).
I S-fasen foregår en fordobling/replikation af DNA. Samtidig med DNA-syntesen foregår syntesen af histoner også. Histonerne syntetiseres på de frie ribosomer i cytoplasmaet og vandrer derefter ind i nucleus og kobler sig sammen med det nyreplikerede DNA. I denne fase finder der stadig syntese af RNA og cytoplasmabestanddele sted. Når DNA-syntesen er afsluttet går det over i G2-fasen. Det er en relativ kort fase, hvor syntesen af organeller i cytoplasmaet og af RNA fortsætter. Herefter gøres cellen klar til den fysiske deling; mitosen. (Prentø og Vagn Jensen 2000)
Mitosen
Mitosen omfatter 5 faser. I de 5 faser foregår kernedelingen og det sluttes af med cytokinesen, hvor cytoplasmaet og organellerne fordeles i to datterceller. Ved begyndelsen af mitosen er kromosomerne duplikeret og hvert kromosom består af to ensartede kromatider. Slutresultatet bliver to datterceller med hver deres sæt kromosomer. (Bremer 1997)
1: Profasen
Her kondenseres kromosomerne til tykke strukturer, hvilket gør at strukturen kan modstå et større træk, når kromosomerne trækkes mod polerne. Mikrotubuli bliver depolymeriseret. Mikrotubuli er rørformede cytoskeletelementer, med en diameter på ca. 25 nm. De er opbygget af dimere proteiner, der kan polymeriseres til mikrotubuli. En tubulin-dimer er opbygget af to omtrent ens proteiner kaldet α-tubulin og β-tubulin. Sådan et proteinrør består af 13 rækker af tubuliner. Golgiapparatet og endoplasmatisk reticulum brydes ned og deles i små vesikler. Herved opnår man, at organellerne vil fordele sig jævnt i hele cytoplasmaet. (Prentø og Vagn Jensen 2000)
Herefter ophører cellen alle kontakter til andre naboceller. Der findes flere forskellige kontakter og den, der forekommer ved de fleste celler, er gap junctions. Her er der kanaler mellem nabocellerne, så der kan foregå en passage af lavmolekylære stoffer fra den ene celle til den anden. Desuden findes der også desmosomer og tight junctions, hvilket typisk ses hos epitelceller, hvor der er større behov for signalering igennem naboceller, og hvor det er muligt, at en celle kan komme i kontakt med intermediære filamenter i cytoskelettet i en nabocelle. Cellen er nu lukket for signaler udefra.
De to centriolepar skilles og vandrer mod hver deres pol. På vejen mod polerne dannes en aster som består af mikrotubuli der bliver udspundet fra de to centriolepar. Derved opstår spindlen, som er et tenformet system. Til slut opløses nukleolus og kernehylstret og de to kromatider i et kromosompar hænger sammen i centromerregionerne. Ved centromerregionerne ses kinetochoret. Det er et fasthæftningssted på kromosomerne for mikrotubuli. Herved er hele det mitotiske apparat dannet. (Prentø og Vagn Jensen 2000)
2: Metafasen
Metafasen kan opdeles i to faser; prometafasen og metafasen. I prometafasen udgår der spindelmikrotubuli fra centrosom, som er et organisatorisk center for cellens cytoskelet. Det indeholder et centriolepar. De to tøndeformede centrioler består af 9 tredobbelt korte mikrotubuli i en cirkel og de står vinkelret på hinanden. Spindelmikrotubuli sætter sig fast på kinetochoret, hvilket er placeret i hvert kromatids centromer. Kromosomerne samler sig herefter i cellens ækvatorialplan og herefter går det over i metafasen. (Prentø og Vagn Jensen 2000)
Kromosomerne samles i ækvatorialplanet midt mellem de to poler. Det kan forklares ved at mikrotubuli er polariserede. Derfor har det rørformede cytoskeletelement en positiv ende og en negativ ende. De to kinetochorer på kromosomerne er bundet til hver sin mikrotubulus positive ende, og mikrotubulus negative ende er bundet til centriolen i hver pol. Herved vandrer kromosomerne mod en bestemt pol. De to centrosomer har spindelen udspændt mellem de to poler. Hvert kromosom bestående af to kromatider er hæftet fast til 30-40 mikrotubuli, som er hæftet fast til begge centrosomer. Så hvert kromatid i et kromosom vender ud mod hver sin pol. De to poler kan nu trække i kromatiderne. For at opnå en lige fordeling, så trækkes det ene kromatid til den ene pol og det andet kromatid til den anden pol. (Prentø og Vagn Jensen 2000)
3: Anafasen
I denne fase løsnes de to kromatider i hvert kromosom fra hinanden og transporteres mod hver sin pol ved hjælp af spindelfibrene. I starten er kromatiderne dog stadig holdt tæt sammen. Det kan forklares ved at enzymet topoisomerase II ikke er færdig endnu. Det er et enzym, der kan nedbryde strengene i en DNA-dobbelthelix og udligne supercoiling. Supercoiling er et fænomen, hvor DNA-dobbelthelixen får flere vindinger og dvs., at det er sværere at åbne dobbelthelixen. Mange supercoils folder DNA-dobbelthelixen sammen, og den fylder herved mindre. Der kan også stadig sidde DNA-bindende proteiner fast på kromosomerne. Det kan være histoner eller nonhistoner. Det er proteiner, som kan holde strukturen sammen i kromosomerne. En forhøjet aktivitet af topoisomerase II spalter kromosomerne fra hinanden, og kromatiderne flyttes herefter mod hver sin pol. (Prentø og Vagn Jensen 2000)
4: Telofasen
De forhold som var gældende under interfasen oprettes igen. Den beskyttende GTP-tubulin i den positive ende af mikrotubulus fjernes og herved nedbrydes mikrotubulus meget hurtigt. Derved er der ikke noget træk i kromosomerne mere og den normale struktur i cellen gendannes. Enzymet topoisomerase II bliver aktivt igen. Det despiraliserer kromosomerne som beskrevet under (2.2.3). Herefter dannes der et kernehylster rundt om hvert kromosomsæt og nukleolus gendannes. Herved er cellen klar til at blive delt vha. aktin- og myosinfilamenter. (Prentø og Vagn Jensen 2000)
5: Cytokinesen
Her sørges der for, at organellerne fordeles ligeligt mellem de to datterceller inden indsnøringen finder sted. Der findes typisk mange mitochondrier, lysosomer og andre organeller, så det er ikke noget problem at fordele dem. Problemet ligger ved golgiapparatet og ved det endoplasmatiske reticulum (ER). Man ved ikke, hvordan det fordeles ligeligt, men man ved at det finder sted. Der forskes stadig på det område. Nu er cellen klar til at dele cytoplasmaet i to celler. Allerede i telofasen blev der dannet en ring bestående af minisarcomerer med aktinfilamenter, myosin II og α-aktinsystem. Denne ring sidder rundt om cellen og ved en kontraktion af aktin og myosin dannes der en indsnøring. Herved er der dannet to datterceller med ens funktioner som modercellen men ikke med samme størrelse. (Prentø og Vagn Jensen 2000)
Regulering af cellecyklus
Når cellen forbereder sig til en deling, er der overordnet to faktorer, som spiller en rolle. Det er det intracellulære genetiske program og de ekstracellulære signaler. Det gælder dog kun celler, som er i stand til at dele sig. Det vil sige, at bl.a. de fleste tværstribede muskelceller og nerveceller ikke besidder dette program, og derfor ikke har muligheden for at dele sig, da der heller ikke findes den slags stamceller.
Der findes mange forskellige ekstracellulære signaler og overordnet er der hæmmende og fremmende faktorer. De findes typisk som hydrofile eller lipofile molekyler. Blandt de lipofile molekyler, kan steroidhormoner nævnes. Da de er lipofile, kan de passere den lipidholdige cellemembran og påvirke intracellulære receptorproteiner i kernen eller i cytoplasma og derved starte transskription af bestemte gener. De hydrofile molekyler kan ikke passere cellemembranen og bindes derfor til receptorer i/på cellemembranen. Det kan stimulere adenulatcyklase som er et enzym der er bundet til cellemembranen. Det vil danne cyklisk AMP ud fra ATP, der kan aktivere flere forskellige kinaser, hvilket er enzymer, der fungerer ved at phosphorylere andre proteiner i cytoplasmaet. Det kan påvirke en genaktivitet og være et led i starten af en cellecyklus. (Campbell m.fl. 1999)
Ca2+ spiller en afgørende rolle, da det intracellulært er med til reguleringen af en cellecyklus. I slutningen af G1-fasen ændres permeabiliteten for Ca2+ og det medfører en stigning i koncentrationen af Ca2+ intracellulært. Det medfører at G1-fasen afsluttes og S-fasen påbegyndes.
Som før nævnt findes der også hæmmende signaler. En negativ vækstfaktor kan være interferoner. De modvirker væksten af virusinficerede celler. Desuden vokser normale cellekulturer heller ikke uhæmmet. De kan ved kontaktinhibition mærke tætheden af celler i et vævsområde. Er der mange celler, vil kontaktpunkter i cellerne påvirke de intracellulære signaler og herved hæmme en cellecyklus. Det er netop det cancerceller kan undgå og herved ukontrolleret dele sig. Der findes også andre ioner som har en indflydelse på reguleringen. Under en cellecyklus ændres permeabiliteten for Na+, K+ og H+ i cellemembranen. Det er påvirkninger, som spiller en rolle ved aktiveringen af de indre genetiske programmer. (Campbell m.fl. 1999)
Når en celle deler sig, er der flere forskellige faktorer som skal være opfyldt. Ved den mitotiske deling er slutproduktet to datterceller. De har ikke det samme volumen som modercellen og er derfor nødt til at opnå det samme volumen for at have muligheden for at dele sig. Denne masse kaldes den kritiske masse, og skal selvsagt opfyldes før en deling kan finde sted. Inden mitosen indledes, skal replikationen af DNA være færdig uden fejl. Det mitotiske apparat skal være opbygget samtidig med at kernemembranen nedbrydes. Det er kun få af de ting, som skal være opfyldt og de styres overordnet af to forskellige intracellulære systemer. Det ene system består af cycliske variationer og det andet er i form af checkpoints, som kontrollerer, at de enkelte stadier er afsluttet før ny stadier påbegyndes. De to systemer hænger sammen, og er bare ét led i kæden ikke opfyldt, stoppes en cellecyklus. (Campbell m.fl. 1999)
Overgangen fra én fase til en anden fase er reguleret af forskellige cellulære proteiner. Der findes cycliner og cdk’er. Cycliner er en familie af forskellige proteiner, og de fungerer sammen med de cyclinafhængige kinaser (cdk). De kan danne komplekser og aktiveres ved overførsel af phosphatgrupper til den cyclinafhægige kinase. Se figur 2.
Figur 2. Diagram over normal cellecyklus, med regulative proteiner (cycliner og kinaser) der styrer overgangen mellem de forskellige faser. Læs tekst for yderligere forklaring. Kilde: Egen illustration, efter HHMI, W. Maxwell Cowan 1995 og Prentø og Vagn Jensen 2000
Når en celle modtager vækstfaktorer, dannes proteinet cyclin D. Det er et protein, som normalt ikke findes i cellen. Til gengæld er der er altid en vis mængde af cdk’er i cytoplasmaet. Derfor går cyclin D sammen med cdk4 og danner et proteinkompleks. Kinasen bliver herefter aktiv og komplekset sætter phosphat-grupper på andre proteiner. I dette tilfælde sættes phosphat-grupperne på retinablastom-proteiner. Rb-proteiner bindes normalt til E2F-transkriptions-faktoren og herved er E2F inaktiv. Men phosphoryleringen af Rb-proteinet får det til at ændre form og kan herved ikke binde sig til E2F-transkriptionsfaktoren mere. E2F bliver aktivt og påbegynder en produktion af de proteiner, som bruges under celledelingen. Desuden forberedes kromosomerne til replikationen. Cyclin D findes faktisk i tre former som er D1, D2 og D3. De er alle essentielle og bindes desuden til cdk6 i G1-fasen. (Foghsgaard m.fl. 2001)
I slutningen af G1-fasen findes cyclin E, som binder med cdk2. Cdk2 binder desuden med cyclin A som stiger i koncentration under S-fasen. De to komplekser danner begge det, man kalder SPF. SPF er betegnelsen for ”start promoting factor”. Det bevirker, at cellen går over i S-fasen og påbegynder replikationen af DNA og centrosomerne. SPF er et heterodimer protein og består derfor også af cyclin og en kinase som de andre nævnte komplekser. (Prentø og Vagn Jensen 2000)
Cellen fortsætter herefter over i G2-fasen og er klar til at gå ind i selve mitosen. Under replikationen af DNA falder koncentrationen af cyclin E og det medfører en stigning i koncentrationen af cyclin A. Cyclin A binder med cdk1. Cdk1 kan også betegnes cdc2 ved mindre komplicerede eukaryoter. Tilsammen kaldes det for MPF(kan sammenlignes med SPF). MPF står for ”mitosis promoting factor”. Se figur 3.
Figur 3. Dannelsen af det aktive MPF kompleks, som består af Cdk og Cyclin. Kilde: Egen illustration, efter Prentø og Vagn Jensen 2000
Der sker altså en stigning af MPF op til begyndelsen af mitosen, og cellen påbegynder mitosen. MPF stiger altså sammen med cyclin. Det får de to centriolepar til at danne en aster og spindlen bliver lavet. Desuden kondenseres kromosomerne. Herefter kommer cellen over i metafasen, hvor APC/C aktiveres. Det står for ”anaphase promoting complex”. Det får kromatiderne til at vandre mod hver deres pol og færdiggør mitosen. Dette kompleks består cyclin B og cdk1. I slutningen af mitosen nedbrydes cyclin B da det bindes med proteinet ubiquitin. Ubiquitin nedbrydes af proteasomer, og herved nedbrydes cyclin B også og cellen træder ind i G1-fasen. Funktionen af mange af de forskellige cycliner er stadig ikke helt fastlagt. Derfor er det stadig et område, hvor der forskes meget. (Campbell m.fl. 1999)
Det andet kontrolsystem bestod af checkpoints. Det er punkter i løbet af en cellecyklus, hvor delingen afbrydes, hvis noget er forløbet forkert. Det søger for at en proces er afsluttet før en ny kan begynde. Hvis der er sket en skade på cellens DNA, vil et checkpoint stoppe celledelingen og give tid til, at cellen kan reparere det skadede DNA. Herefter kan celledelingen fortsætte. Hvis skaden ikke er til at reparere, så vil det medføre apoptose. På den måde får celler med beskadiget DNA ikke lov til at formere sig.
Det første checkpoint er placeret ved overgangen til S-fasen (jf. figur 1). Det er et G1-checkpoint. Her tjekkes for koncentrationen af cyclin E. Da cycliner hurtigt nedbrydes i cytoplasmaet, betyder det, at dette checkpoint er i stand til at undersøge om cellen f.eks. har nok næring i cellen. Er der ikke nok næring vil koncentrationen af cyclin E være lavere end normalt, og så vil SPF ikke blive dannet, og cellen får ikke lov til at passere dette checkpoint. (Cowan 1996)
Ved overgangen til mitosen ligger et andet checkpoint. Det er G2-checkpoint der tjekker om DNA er blevet replikeret og er klar til mitosen. Det sker ved at stoffet aphidocolin inhiberer replikasens polymeraseaktivitet. Her findes en endnu ukendt faktor som registrerer at DNA er replikeret og lader cellen passere dette checkpoint. Hvis det ikke er tilfældet og der er sket en skade på DNA, så vil skaden blive rettet eller cellen bliver trigget til apoptose.
Det er ikke kun ved DNA at checkpoints fungerer. Når kinetochorer ikke har bundet sig med mikrotubuli, udsender de signaler. Det vil sige, at fraværet af disse signaler er med til at lade cellen passere et checkpoint. Cellen tjekkes for et utal af funktioner og er der problemer med bare en enkelt funktion, så afbrydes celledelingen. (Cowan 1996)
Opslag
