Formål
Der er blevet observeret Europæiske sumpskildpadder (Emys orbicularis) i Danmark, nærmere bestem ved Salten Å (vi kigger på to herfra) og i Igelsø. Spørgsmålet som rejser sig er så, hvorfra kommer disse? Vi er blevet præsenteret for to teorier, men en tredje eksisterer:
1. En naturvejleders overbevisning om at sumpskildpadden har overlevet i Midtjylland, og ikke er uddød for 2000 år siden, som ellers antaget. De skulle efter hans udsagn være en lille population, af den oprindelige danske (Nordeuropæiske) underart. Denne overlevelse skulle ske uden egentligt beskrevne observationer.
2. At det er købte kæledyr som enten er sat ud i få eksemplarer, eller at de systematisk er blevet sat ud, slægten skulle så være af de fra Balkanområdet, nærmere bestemt Serbien og Ukraine, da det er disse man kan købe i dyrehandlere.
3. En tredje teori, som vi dog ikke får direkte beskrevet, er den at det er en ny underart, eller race, af de udsatte som på de år der skulle være sat dyr ud (hvilket ikke kan være mere end 100 år, hvis overhovedet) skulle have evolutioneret sig til en underrace. Dette ville kun kunne forekomme hvis individet muterede, dette er sandsynligt, men sandsynligheden må siges at være så lille at denne teori, uden videre kan forkastes.
Man kan sige meget om den første teori, hvis jeg skal komme med en kommentar, ville jeg umiddelbart kalde det for pop-biologi, da denne teori vækker stor medieinteresse, men ikke umiddelbart har det store i sig. Da denne naturvejleder som vi bliver præsenteret for ikke kommer med nogen konkrete beviser, men bare en masse indicier og postulater. Dog kan man sige at den er blevet bredt accepteret, eksempelvis kan det nævnes at på et ellers så informativt online leksikon som wikipedia, kan man læse; ”Europæisk sumpskildpadde (Emys orbicularis) blev genopdaget i Danmark, Midtjylland i
Vores formål med denne øvelse er så, at fastlægge, hvorfra disse observerede skildpadder egentlig er fra. Vi har DNA fra Salten Å, Polen, Ukraine, Grækenland og Serbien. Hvis deres DNA matcher med dem fra Balkanområderne, må man konkludere at de er udsatte, hvorimod, er de forskellige kan man sige at de er overlevende eksemplarer fra den 2000 år gamle Midtjyske underart.
Teori
Der er en del teoretisk stof, som skal frem her, så jeg har valgt at opdele det i disse 4 underemner:
· Europæisk sumpskildpadde:
Den Europæiske sumpskildpadde, Emys orbicularis er en skildpadde som findes i Syd- og Centraleuropa, Vest Asien og Nord Afrika, men da denne har så store udbredelsesområder beskriver man ofte den europæiske som en undeart ved navn Emys orbicularis orbicularis for at kunne skelne mellem den og en anden også udbredt underart Emys orbicularis orientalis.
Den lever i langsomt rindende vand, og overvintrer i op til 7 måneder. Den ligger æg, som mange andre krybdyr, og for at disse skal kunne udklække, skal sommerens varmeste måneds gennemsnitstemperatur være over
· Elektroforese og restriktionsenzymer:
En elektroforese er en slags sining af DNA-stykker. Men før man kan gå i gang med elektroforesen, skal man ha klippet sit DNA i stykker. Til dette bruger man restriktionsenzymer, der er specielt designet til at klippe efter en speciel kode. De enzymer vi brugte hedder ECO R1 og PST R1, og disse klipper henholdsvis ved G eftf. af AATTC og ved CTGCA eftf. af G, dette ser således ud:
Når man har klippet DNA’et i mindre stykker tilsætter man en tung markørbuffer, så man senere i forsøget kan se, hvor langt DNA-stykket er vandret.
Gelen, den såkaldte si, er lavet af agarose, deioniseret vand og gel buffer. Agarose er som navnet antyder et sukker (kulhydrat), som er udvundet af japanske rødalger. Mængden af agarose afgør hvor tæt ”filtret” bliver, har man små sekvenser af DNA ønsker man et tæt filter, og man tilsætter derfor meget agarose. Da vi skulle fremstille den opløste vi
Når man har afsat sit DNA materiale i gelen sætter man strøm til hver ende af badet. I den ene ende er anoden (positiv elektrode) og i den anden er katoden (negativ elektrode). Man har vendt gelen sådan, at den ende man har afsat miks i vender væk fra anoden. Dette er fordi DNA-molekylerne er negativt ladede, så de vil vandre mod anoden. Vandringen gennem gelen foregår i forskellige tempi afhængigt af molekylets størrelse. Jo større molekylerne er jo langsommere bevæger de sig gennem gelen. Grunden til man har tilsat markørbufferen, er at den altid vil bevæge sig hurtigere end nogle af DNA-molekylerne, så når markøren er kommet ned til den anden ende slukker man for strømmen.
· PCR, farvemarkøren og TAE bufferen:
Et enkelt kritisk problem i dette forsøg er mængden af DNA materiale, for at kunne lave en ordentlig elektroforese, som skal give et realistisk billede, har man brug for meget DNA materiale. Har man ikke det, kan man bruge en molekylærbiologisk opformeringsmetode som kaldes PCR, Polymerase Chain Reaction (Polymerase kæde reaktion) som blev opfundet så tidligt som 1983 af Kary Mullis, som 10 år senere modtog Nobels Kemipris for netop denne opdagelse. Som navnet antyder, er det en kunstigt fremstillet replikationsmetode. Den er relativt simpel, jeg har prøvet at illustrere det i nedenstående figur:
· Trin 1: DNA’et hældes ned i en beholder, sammen med polymerase og frie nucleotider.
· Trin 2: Hele substansen opvarmes til lidt over
· Trin 3: Substansen nedkøles igen til under
Den farvemarkør jeg nævnte i teoriafsnittet om elektroforese, skal som sagt angive hvor langt DNA stykkerne er nået i gelen, de skulle jo nødig vandre helt igennem den. Dette forudsætter at stykkerne i markøren er mindre end de mindste DNA stykker. Men det er også lavet sådan i vores forsøg, så markøren har en hastighed på 500bp, som svarer til en sekvens på 500 basepar. De streger denne markør laver, vil kunne ses med det blotte øje, så man som sagt ved hvornår man skal slukke.
TAE-bufferens (Tri-Acetat-x) essentielle rolle er at holde DNA’ets pH stabilt på 7.6. Dette skal gøres fordi en pH værdi på 7,6 sikrer at DNA’et forbliver negativt ladet. Billedet til højre viser AMP Adenosine monophosphat, som er en nucleotid, og man kan se den negative ende med O-.
· Størrelsesmarkøren:
I dette forsøg er det vigtigt at kunne sammenligne størrelsen på de udskårne DNA stykker, så for at have en reference bruger man en såkaldt størrelsesmarkør, som i dette tilfælde er en DNA-størrelsesmarkør. Det DNA vi brugte stammede fra en virus, og vi må formode at det er en virus som forskere har bestemt hele dens genom, og derfor alle basesekvenser. Så da vi kender størrelsen på alle fragmenterne, og måler på hvor langt de er vandret i gelen, kan vi lave en graf i et enkeltlogaritmisk koordinatsystem. Dette viser antallet af basepar op ad 2. aksen, og antal vandrede mm. i gelen, ud af 1. aksen. Resultatet ses i afsnittet: ”resultater”.
Metode
jf. øvelsesvejledningen.
Fejlkilder
Under forsøget kom vi til at hælde TAE bufferen ned i røret til sidst. Af den grund blev vores DNA-prøver en smule udtværet. Men dette ændrede ikke på resultatet, som i sidste ende blev det bedste, set i forhold til de andre gruppers. En fejl er det, men måske en forbedrende én af slagsen.
En anden mulig fejlkilde, som dog ikke er dokumenteret, kunne være at gelen ikke er fuldstændig homogen, men at koncentrationen af sakkarose kunne være bare en brøkdel større i nogen områder af gelen, dette ville så føre til udsving i vandringen.
Resultater
Jeg har valgt at bruge fabrikantens (BIO-RAD) billede af gelen, da dette vil give de mest korrekte resultater.
1: Størrelsesmarkør
2: Salten 1
3: Salten 2
4: Polen
5: Ukraine
6: Grækenland
7: Serbien
Her ses resultatet fra regressionen over vores virus-DNA:
Den blå linie som ses, er eksponentiel regression, og den funktion man får ud af den er tegnet med tynd stiplet linie.
Jeg har så lavet en forskrift, så man kan udregne antal basepar ud fra antal vandrede mm. Jeg har dog valgt at udelukke det første punkt med 23.130 basepar, da denne afviger fra den ellers rette linie i det enkeltlogaritmiske koordinatsystem, men med de andre resultater kommer forskriften til at se således ud: 
, hvor f(x) er antallet af basepar, og x er antal vandrede mm. Ud fra denne model, og de målte afstande fra gelen, kan man opstille et skema, som viser de forskellige bånds basepar for de forskellige skildpadders DNA:
| Salten 1 | Salten 2 | Polen | Ukraine | Grækenland | Serbien |
| 3648 | 2820 | 2970 | 3821 | 3189 | 2969 |
| 2969 | 1112 | 1773 | 3078 | 2620 | 2070 |
| 740 | 862 | 1117 | 740 | 1061 | 1116 |
Diskussion
Kigger man på skemaet over sumpskildpadder og deres basepars størrelser, kan man relativt nemt fastslå, at skildpadden ”Salten
Et andet faktum som man kan se ud fra gelen, er at de alle er meget nært beslægtede, dette vidste vi dog på forhånd, men det er tydeligt illustreret i skemaet i det at de alle har en DNA sekvens omkring 3000 basepar. Nærmere bestemt er gennemsnittet af de bånd på 3016, og den største afvigelse fra dette er Grækenland med 173 basepar, og igen ligger dette inden for usikkerhedsmarkøren.
Vi fik indledningsvist af vide, at; ”… hvis sommerens varmeste måneds gennemsnits temperatur bliver under 18°, kan deres æg ikke klækkes” Dette faktum undersøgte jeg, og fandt fra DMI’s hjemmeside en afbildning af Midtjyllands klima fra 1961 til 1990:
Og som det tydeligt fremgår af den mørke streg som angiver middeltemperaturen har gennemsnitstemperatu-ren i den varmeste måned (juli med et gns. på 15,4° C) ikke været i nærheden af de påkrævede 18° C, så det giver et dilemma. Enten må man helt forkaste vores resultater, som ellers kraftigt tydede på at de stammede fra den oprindelige danske underart, eller også må man vælge at se bort fra det faktum, at der i en årrække på 29 år, ikke har været en middeltemperatur på 18° C.
Hvis vores restriktionsenzymer ikke havde virket ville vores gel have givet os et meget dårligt billede at arbejde med, for i og med at der ikke ville blive klippet nogen steder i DNA’et, ville det blive én meget lang basesekvens, som ville bevæge sig meget lidt i gelen, da agarosemængden er tilpasset meget mindre stykker. Derfor ville vi blot se én stor streg lige ude for brønden, og vi ville ikke kunne bruge dette resultat til noget.
Konklusion
Nu da jeg er nået til konklusionen, burde jeg have ét endegyldigt svar. Dette er bare ikke tilfældet. Jeg har to modstridende argumenter: Vælger man blot at kigge på gelen, vil jeg fastslå at sumpskildpadden Salten 1 er en udsat ”stakkel”, da dens sammensætning af DNA-sekvenser minder slående meget om den fra Ukraine, hvilket også er den man kan købe i de danske dyrehandlere. Og Salten 2, er en overlevende underart, som har levet i delvist skjul i 2000 år.
Vælger man derimod også at kigge på grafen fra DMI, ser vi her det modstridende argument. Der har i perioden 1961-1990 ikke været én juli med en gennemsnitstemperatur på de påkrævede 18°. Dette indikerer så, at det ikke er en overlevende og fødedygtig population, da den simpelthen ikke ville have nogen måneder som er varme nok til udklækkelse af dets æg.
Jeg vil dog sige, at skal dette forsøg blive en succes, må vi bortkaste argumentet med de nødvendige 18°, da dette helt spolerer det ellers så fine resultat; at der findes en overlevende vild sumpskildpadde i Danmark. Eller også skal vi vende den om, og finde en løsning på dette problem. Og en mulig teoretisk løsning på problemet kunne være, at skildpadden har været udsat for et selektionspres, som skulle forfordele evnen til at lægge æg som kan udklækkes ved lavere temperaturer, således at der simpelthen er sket en evolution i forhold til de sumpskildpadder i Sydeuropa. Dette ville give særdeles god mening.
Opslag
