1.0 Formål
Formålet med dette forsøg og dertilhørende rapport er, at undersøge resistensbegrebet på teoretisk og praktisk niveau, og undersøge resistens hos udvalgte bakterier med udvalgt antibiotikum.
2.0 Teori
2.1 Mikrobiologi
Mikrobiologi er det studie der undersøger de mindste levende organismer der findes på Jorden. Mikroorganismerne er grænsen for hvor småt liv kan være. Alt liv er også udsprunget fra simple encellede organismer (jf. figur 1) ca. 4 milliarder år tilbage, og de næste 3 milliarder år bestod alt liv på jorden af disse simple skabninger. Man har fundet mange eksempler på flere hundrede millioner år gamle mikroorganismer, svampe, alger og bakterier i harpiks, og ud fra disse studier kan man se, at morfologien og anatomien i disse organismer ikke har ændret sig væsentligt, og lægger man det sammen med hvor mange forskellige arter der er, giver det et billede af, at denne klasse af organismer er yders vigtige og overlevelsesdygtige.
De fleste mikroorganismer reproduceres hurtigt, og i stort antal (tilnærmelsesvist eksponentielt), og dette blandet med den egenskab at de ofte kan udveksle gener på tværs af familier (horisontal genudveksling), og at de har en høj mutationsrate gør mikroorganismer i stand til at udvikle sig gennem naturlig selektion, og dette istandgør dem til overlevelse alle steder på kloden, og i stort set alle miljøer. Der er dog også, set med menneskesyn, en ulempe ved denne hurtige tilpasning: I denne opgave skal vi undersøge mikroorganismers resistens over for antibiotikum, og da disse organismer hurtigt tilpasser sig og immuniseres, vil resistens være et yderst omfattende problem, især i miljøer med stort forbrug af netop antibiotikum (jf. Et senere kapitel).
Historisk set har man altid kendt til mikroorganismer, dog i mange år uden selv at vide det. Det var nemlig mikroorganismers egenskab der lavede vindruesaft til vin, dannede alkohol i øl og fik mad til at gå i forrådnelse. I denne tid troede man, at der spontant kunne opstå liv abiogenesis, altså en abiotisk oprindelse/skabelse. Men i 1676 opdagede hollænderen Anton van Leeuwenhoek med mikroskopets virke mikroorganismer. Det var dog ikke ham der direkte fik bevist at det var mikroorganismers liv der skabte de ovenstående processer, men han opdagede at der fandtes liv mindre end hvad det menneskelige øje kunne registrere, det er på baggrund af denne opdagelse at han ofte kaldes mikrobiologiens fader.
Den umiddelbare opdeling i mikroorganismer finder man ved prokaryoter og eukaryoter: prokaryoter er som navnet antyder pro (før) kerne, altså disse organismer har ingen cellekerne til beskyttelse af arvemateriale. Da de ikke har en kerne ligger arvematerialet frit i cytoplasma. Inden for prokaryoterne inddeler man i bakterier og arkæer. Den anden gruppe, prokaryoter er alle andre skabninger på jorden. Dyr, planter, slimsvampe, men også mange mikroorganismer, heriblandt svampe, alger og andet. Her følger en liste over de forskellige klasser af mikroorganismer:
- Bakterier (prokaryot)
- Arkæer (prokaryot)
- Svampe (eukaryot)
- Alger (eukaryot)
- Protozoer (eukaryot)
- Flercellede dyr (eukaryot)
- (virus) bliver af mange ikke regnet for en egentlig levende organisme[1]
[1] En lektor på Det Biovidenskabelige Fakultet (tidligere KVL) nævnte til en prøveforlæsning i forbindelse med åbent hus arrangement, at man ikke regner dem som levende, da virus kun kan formere sig inden i andre celler, fx i bakterier, planter og dyr, og også på grund af virus mangel på selvstændigt stofskifte, men afhængighed af værtscellens stofskifteapparat som den overtager og omstiller til at producere flere virus.
Nedenfor er et stamtræ (figur 1) over det tidsmæssige stamtræ:
At man har fastslået arkæer til at være mere beslægtet med eukaryoter, skyldes at der i og omkring deres arvemateriale er proteinet histoner, som også eukaryoter indeholder.
Figur 1 viser et stamtræ, over de forskellige klasser bakterier (prokaryot), arkæer (prokaryot) og alle de eukaryoter. Af: Torlein Torkel, efter Wikipedia.orgKlik på billedet for at få det frem i en større udgave (lettere læselig)
Som navnet antyder, kan disse organismer kun ses (enkeltvis) i mikroskop, men i disse mikroskoper kan man også få indblik i for stor forskellighed der er iblandt; forskellige former, farver, størrelse, overfladeform og bevægelses-mønstre og metoder. Dog kan lange flercellede alger (tang) og kolonier af bakterier og svampe (eksempelvis mug) ses med det blotte øje. Nedenfor ses en figur (figur 2) som viser de relative størrelsesforhold mellem prokaryoter, eukaryoter, biomolekyler og atomer:
Figur 2 viser den relative størrelse af de forskellige organismer, og biomolekyler. 2. aksen er et logaritmisk metrisk system som starter ved 10-9 m (1 nm) og slutter ved 10-3 m (1mm). Af: Torlein Torkel, efter Wikipedia.org
Klik på billedet for at få det frem i en større udgave (lettere læselig)
2.2 Resistens
Resistens er evnen til at modstå. Ordet stammer fra det latinske; resistentis, som betyder ”at blive stående, gøre modstand” I vores forsøg undersøger vi som nævnt resistens hos bakterier over for forskellige antibiotikum. Resistens er i sig selv ikke nødvendigvis et onde (vi er selv resistente overfor mange stoffer!) men problemet opstår hvis resistens hos en harmløs bakterie, spredes til andre mere farlige bakterier.
2.2.1 Antibiotikum
Ordet antibiotikum siger det hele: Anti: imod bios: liv, altså det at to stoffer ikke kan eksistere i hinandens nærhed. Det at nogle stoffer har den effekt på andre stoffer, molekyler og organismer udnytter man i lægevidenskaben til at producere lægemidler som hæmmer eller dræber sygdomsfremkaldende mikroorganismer. Antibiotikum er ikke et enzym, men et molekyle som kan gå ind og virke på mikroorganismer på flere forskellige måder. De kan gå ind i cellemembranen og hæmme denne i at udvide sig, dvs. at bakterien ikke kan vokse eller dele sig. Den kan ligeledes ændre cellevæggen, med henblik på samme hæmning. Derudover kan de hæmme proteinsyntesen forskellige steder, enten i transskriptionen, translationen eller den kan simpelthen gå ind og ændre vitale dele i arvemassen.
I vores forsøg arbejder vi med 7 forskellige typer antibiotikum:
1: tetracyklin (tet)
2: ampicillin (amp)
3: sulfonamide (sul)
4: penicillin (pen)
5: bactracin (bac)
6: chloramphemicol (chl)
7: stroptomysin (str)
2.2.2 Fysiologiske forhold der kan frembringe resistens
Resistens kan opstå på forskellige måder og komme til udtryk på forskelligt. Men ændringerne vil altid skyldes naturlig selektion, eller i andre tilfælde programmeret evolution. Naturlig selektion er en del af Darwins arveligheds- og oprindelseslære. Antibiotikummets virke kan ses som et miljøbetinget pres for de bakterier der udsættes for det. Derfor vil der være et kraftigt selektionspres for at kunne modstå, ergo vil de bakterier der muterer til resistens have en fordel, og deres gener vil i form af nye individer blive ført videre. Dette kan illustreres ved følgende figur:
Figur 3: Skematisk præsentation af hvordan antibiotikaresistens udvikles gennem naturlig selektion. Den øverste del ”før selektion” repræsenterer en population af bakterier før tilsætning af antibiotikum, i næste fase er selektionen sket, det vil sige at nogle bakteriestammer er selekteret fra, og kun de med resistens overlever. Den tredje fase er den nye generation af resistente bakterer. En ekstra kommentar kunne også knyttes til, hvis antibiotikummet blev ændret en smule, ville de bakterier der befinder sig i næsthøjeste resistensniveau være mere udsatte end de med det højeste. Herfra kunne endnu en selektion finde sted. Af: Torlein Torkel, efter Wikipedia.org
Klik på billedet for at få det frem i en større udgave (lettere læselig)
De former for resistens der kunne udvikles i den endelige population (jf. figur 3) kunne være en egentlig passiv resistens overfor stoffet, eksempelvis hvis antibiotikummet ikke længere kunne bindes på sit målsted, men en værre form for resistens ville være produktionen af et enzym der aktivt kunne nedbryde antibiotikummet, som eksempelvis stafylokokkbakterien Staphylococcus aureus der kan producere penicillinase (enzym der spalter penicillin). Grunden til at denne mutation med dertilhørende ændring/skabelse af (nyt) enzym, er værre end den passive form for resistens er, at det nye gen for enzymet ville kunne deles horisontalt bakterier imellem, modsat det passive forsvar (som ofte vil være artsspecifikt)
2.2.3 Anatomiske forhold der kan frembringe resistens
Hos bakterier kan der som nævnt være en form for passiv resistens. En art af denne resistenstype har sit udspring i bakteriens cellevæg - de kan enten være tykke eller tynde. Forskellen på en tyk og en tynd cellevæg, kan findes ved nærstudier af disse. Ser man på dem begge vil man se at der uden omkring cellemembranen er denne væg, som kemisk er opbygget af peptidoglykan (som er en sammensætning af aminosyrer peptid og sukkerstof glykan). Derudover er der en række forskelle de to typer imellem:
1: De bakterier med tynd cellevæg har udover væggen endnu en membran, der i opbygning minder meget om cellemembranen, dog findes der indlejret i denne membran forskellige stoffer som lipopolysakkerider, og lipoproteiner, og da de er bygget op af bl.a. lipid, vil de kunne indlejres i membranens lipofile indre.
2: De bakterier med tyk cellevæg og uden ekstra membran
For at kunne identificere de to typer, har danskeren Christian Gram udviklet en metode, hvorved de bakterier med tynd cellevæg ikke farves, dvs. gramnegativ, og hvor de bakterier med tyk cellevæg farves, dvs. grampositiv. Denne form for inddeling er relevant for vores forsøg, da de bakterier der er grampositive generelt er mere modtagelige overfor penicillin, hvilket giver os, at gramnegative bakterier er mere resistente, altså en passiv resistens der udspringer som følge af bakteriens anatomiske forhold. I vores forsøg arbejder vi med tre forskellige bakterier: Bacillus cereus (som er en jordbakterie), Esceria Coli, og en ukendt bakterie fra jordprøver, som jeg kalder Bacillus Magnussenae (dog kan der herske tvivl om renheden af denne koloni). B. Cereus er g+ hvorimod E.Coli er g-, dette kan vi bruge i vores hypotese.
2.2.4 Resistensoverførsel
Som nævnt tidligere kan bakterier udveksle arvemateriale horisontalt. Dette kan ske da bakterier indeholder plasmider, som er et selvstændigt ringformet stykke DNA materiale, som i sig selv ikke koder for noget væsentligt (eksempelvis formering, metabolisme etc.), men i stedet kan indeholde gener som kan forøge organismens overlevelsesmuligheder, hvis de aktiveres i en given situation. Men disse plasmider kan relativt nemt overføres til andre bakterier, hvilket kan ske på tre forskellige måder:
1: Konjugation: Som er en proces hvor to celler selvstændigt udveksler og kombinerer arvemateriale. Det sker ved, at de to cellers membraner smelter sammen, og danner en pilus. Der sker det, at den ene celle (a) vikler sit plasmid op, og overfører det til celle (b), i begge celler vil DNA-polymerase (eller en ækvivalent) påsætte frie nukleotider på de frie pladser.
2: Transformation: Bakterie a dør, og dens plasmider er nu fritsvævende. Bakterie b optager dette arvemateriale og indlejrer det i sit eget. Det er samme teknik man bruger ved gensplejsning.
3: Transduktion: En teknik hvor arvematerialet fra en celle overføres til en anden ved en adenoral virus. Dette bliver også brugt i gentransplantation, hvor man ønsker en egenskab, eksempelvis produktion af et bestemt enzym, dette gen kan så splejses ind i genomet hos en bakterie, som så producerer det ønskede enzym, som så kan opsamles.
3.0 Hypotese
En egentlig hypotese kan ikke findes, da jeg ikke ved noget om de forskellige antibiotikum, deslige bakterierne. Men alligevel vil jeg have den hypotese, at den type bakterie som er grampositiv vil angribes bedre at penicillin. Derudover vil jeg forvente at se afmærkninger af bakteriehæmning rundt om antibiotikumtabletterne, for de tre forskellige bakterietyper. Man kunne være ”heldig” at se en form for resistens. Dette ville kunne ses som små kolonier af bakterier, i en ellers væksthæmmet zone. Grunden til at jeg sætter anførselstegn ved heldig, er selvsagt: Har vi skabt en resistent familie af en af de repræsenterede bakterier, ville denne kunne spredes. Og da vi arbejder med ”rigtige” antibiotikum, er resistensen reel.
4.0 Resultater
4.1 Skematisk oversigt
Nedenfor ses en skematisk oversigt over resultaterne (skema 1):
De steder hvor der er angivet et spørgsmålstegn, fortæller at det ikke var muligt at aflæse et resultat. Ved B. Cereus, skyldes det, at vækshæmmende zoner fra andre antibiotikum var så store at et resultat ikke kunne aflæses. Ved E. Coli, var hele petriskålen blot dækket af væksmedie, hvilket tyder på at antibiotikummet er diffunderet ud på hele pladen, og dermed har dræbt alle bakterier. Desværre.
Skemaet viser i venstre spalte hvilken type antibiotikum der er målt for, og i de tre næste spalter er opstillet de forskellige bakterier. Resultatet er skrevet som radius af den væksthæmmede zone i mm. De steder med resultat 0, er et udtryk for, at der ingen bakteriefri zone var, og at de derfor voksede tæt op ad det givne antibiotikum. Nedenfor har jeg lavet endnu et skema (skema 2), som illustrerer effekten af de enkelte antibiotika v. hver bakterie (dog ikke E. Coli)
5.0 Diskussion
Som det fremgår af skema 2 er der ikke mange ligheder mellem den kendte bakterie B. Cereus og den ukende jordbakterie (B. Magnussenae). Det kan dog undre at B. Cereus ikke reagerede overfor penicillin, da den jo er gramnegativ. Generelt kan man sige om forsøget, at det var godt på visse områder, og mindre godt på andre. Eksempelvis var det en god arbejdsproces, som for mit vedkommende var lærerig, og mange af resultaterne var også tilfredsstillende gode, dog var det en skam at resultatet for E. Coli ikke kunne bruges, og at mange af de andre gruppers forsøg gik i kludder, en bred sammenligning ville være fordelagtigt, da man også bedre ville kunne bestemme forskellige resistensforhold. Som jeg jo nævner ovenfor, er der ikke mange ligeheder mellem B. Cereus og den ukendte jordbakterie, men slår man B. Cereus op, er der reelt tale om en jordlevende bakterie (dermed ikke sagt at jordlevende bakterier nødvendigvis reagerer ens).
En anden interessant observation der dukkede op i forbindelse med resultatbehandlingen, var fundet af enkelte bakteriekolonier der levede i ellers døde zoner. Tydede dette på resistensudvikling? Man kunne frygte det, en fejlkilde som andre bakterier indsluppet i petriskålen, mener jeg kan udelukkes, da mønsteret for væksten af kolonierne ikke tydede på dette. Havde det været en resistent bakterietype fra starten, ville vækstområdet være større – i al fald tog vi ingen chancer, og desinficerede udstyret i autoklavemaskinen.
5.1 Antibiotikaresistens – et samfundsonde
Skulle der som nævnt ovenstående været udviklet resistens, ville det svare godt til hvad der sker mange steder i den ”virkelige” verden – her tænker jeg især på landbrugssektoren, hvor resistensudvikling som følge af overforbrug af antibiotikum desværre er en realitet. Problemet med antibiotikaforbruget i den danske primærsektor, er at det i højere grad bruges præventivt – altså et profylaktisk overforbrug. Der tegner sig altså et billede, hvor sygdomme bekæmpes før den optræder, hvilket omsat i tal betyder at halvdelen af alle danske køer (i traditionelle landbrug, som stadig tegner sig for størstedelen) i løbet af et år bliver behandlet med antibiotikum, for at holde sygdom nede. Men en undersøgelse viser, at antibiotikaforbruget kan nedsættes væsentligt, uden at det går ud over dyrenes helbred. Bønder fra mejeriet Thise, har delvist omlagt deres landbrug, således at behovet for præventiv antibiotikabehandling mindskes. Det er bl.a. kommet til udtryk i ændring af staldenes udformning, hvor konventionelle stalde er opmurede bygninger, med generel høj temperatur, og stor luftfugtighed som følge af manglende luftcirkulation – et sandt paradis for mikroorganismer. Dette har bønderne fra forsøget elimineret ved at bygge stalde uden siddevægge, således at frisk luft kan cirkulere. Sygdomsbekæmpelse foregår stadig præventivt, men uden medicin – eksempelvis ved udspredning af muslingeskaller, hvilket forhindrer mudder omkring klove og yver (som er sygdomsfremkaldende, da dette igen skaber gode levebetingelser for mikroorganismer). Det er således bevist, at man ved relativt simple omlægninger, kan sænke behovet for antibiotika med 50 %, og stadig uden at gå på kompromis med dyrenes ve og vel, hvilket er til gavn for alle.
Opslag
